Eckes, Stefanie (2024)
Modifikation von Proteinen mittels Photosensibilisatoren für die strukturierte Proteinimmobilisierung und Quervernetzung von Biomaterialien.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00026689
Dissertation, Erstveröffentlichung, Verlagsversion

Kurzbeschreibung (Abstract)

Photosensibilisatoren ermöglichen die Modifikation von Proteinen durch Bestrahlung mit sichtbarem Licht. So können Proteine quervernetzt oder gezielt in einem belichteten Bereich immobilisiert werden. Beides ist von Bedeutung für die biomedizinische Forschung, etwa im Bereich der Wirkstofffreisetzung aus quervernetzten Proteinmatrices, zur Herstellung diagnostischer Assays oder zur Untersuchung des Zellverhaltens auf strukturierten Oberflächen.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Proteine mittels proteinadsorption by photobleaching (PAP) oder durch rose bengal and green light crosslinking (RGX) auf Oberflächen immobilisiert oder quervernetzt. In beiden Methoden kommen Photosensibilisatoren zum Einsatz, die durch sichtbares Licht angeregt werden und im Triplett-Zustand mit der Umgebung reagieren können. Während bei PAP der Photosensibilisator, meist Fluorescein, am Protein konjugiert vorliegt, wird bei RGX der Photosensibilisator Bengalrosa zum Protein hinzugegeben.

Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Photoimmobilisierung mittels PAP untersucht, bei der die Belichtung oftmals mit einem Laser oder Mikrospiegelarray (digital mirror device, DMD) realisiert wird. Im Rahmen dieser Arbeit sollte der Einsatz einer Power-LED als lichtstarke kostengünstige Variante für die PAP-Methode untersucht werden und der Belichtung mittels Konfokalmikroskop und DMD gegenübergestellt werden. Hierbei wurde untersucht, ob der Photosensibilisator nicht nur am Protein konjugiert, sondern ebenfalls frei in Lösung oder an der Oberfläche adsorbiert eingesetzt werden kann. Zudem wurden Photosensibilisatoren unterschiedlicher Triplett-Quantenausbeute verwendet und die Effizienz der Proteinimmobilisierung verglichen. Für die Immobilisierungen wurden Biotin und das Modellchemokin IL-8 genutzt. Chemokine sind kleine Signalproteine, die die Migration von Zellen bei Entzündungsreaktionen und in der Homöostase des Immunsystems induzieren und lenken. Durch die Präsentation von Chemokinen auf Oberflächen in Form von gebundenen Gradienten, lässt sich die Migration von Zellen (Haptotaxis) untersuchen. Die Immobilisierung von IL-8 mit der PAP-Methode wurde außerdem mit der konventionellen Photoimmobilisierung über Benzophenon, das mit UV-Licht angeregt wird, verglichen. Bei den Immobilisierungsversuchen von IL-8 mittels Benzophenon auf Polystyrol- bzw. auf mit PMMA beschichteten Polystyrol-Oberflächen konnten keine ausreichend hohen Verhältnisse in der Fluoreszenzintensität zwischen dem belichteten und unbelichteten Bereich (Signal-zu-Hintergrund (S/HG)-Verhältnis) erzeugt werden. Im Gegensatz dazu verlief die Immobilisierung von Biotin-5-Fluorescein auf mit BSA beschichteten Glasobjektträgern mittels Power-LED erfolgreich. Anhand dieses Modellsystems wurden sowohl Konzentration als auch Belichtungszeit optimiert und anschließend auf die Immobilisierung von mit Fluorescein konjugiertem IL-8, IL-8-S72C-Fluorescein, übertragen. Hierbei waren allerdings belichtete Bereiche kaum von nicht belichteten Bereichen zu unterscheiden. Es wurde vermutet, dass IL 8 eine unspezifische Wechselwirkung mit der BSA-beschichteten Oberfläche einging. Die Immobilisierung von IL-8-S72C-Fluorescein bzw. IL-8 mit freiem Fluorescein mittels DMD war auf NH2- und Methacrylsäure-3-(dimethyl-chlorsilyl)-propylester (MACS)-funktionali-sierten Glasobjektträgern erfolgreich. Das größte in dieser Arbeit erhaltene S/HG-Verhältnis wurde dabei auf MACS-funktionalisierten Oberflächen erhalten, mit denen IL-8-S72C-Fluorescein nachweislich nicht unspezifisch wechselwirkte. Mittels konfokalem Laser-Scanning-Mikroskop (confocal laser scanning microscope, CLSM) konnte eine Immobilisierung von IL 8 S72C-Fluorescein auf BSA-Glasobjektträgern im roten Kanal nicht nachgewiesen werden. Im grünen Kanal wurden invertierte Muster erhalten. Vermutlich wurde das Protein durch zu lange bzw. zu intensive Belichtung oxidativ geschädigt. Im Gegensatz dazu, konnte IL-8 wt mit freiem Fluorescein nachgewiesen werden. Es wird angenommen, dass der oxidative Schaden geringer war, da Fluorescein nicht direkt an IL-8 gebunden vorlag. Da Fluorescein eine geringe Triplett-Quantenausbeute besitzt, wurde die Immobilisierung von Biotin und IL-8 mit den Photosensibilisatoren Eosin Y, Erythrosin B und Bengalrosa untersucht, die eine höhere Triplett-Quantenausbeute besitzen, und damit effektiver mit der Umgebung reagieren sollten. Die besten Ergebnisse wurden dabei unter Nutzung von mit Bengalrosa und Rattenschwanzkollagen bzw. Gelatine beschichteten Glasobjektträgern erzielt. Unter Verwendung eines Konfokalmikroskops konnten die Ergebnisse der Immobilisierung von IL 8 wt auf mit Rattenschwanzkollagen und Bengalrosa beschichteten Glasobjektträgern weiter verbessert werden. In nachfolgenden Arbeiten wurde die Immobilisierung von IL-8 mittels Bengalrosa auf Kollagen in Mikrofluidikkanälen untersucht. Zusammenfassend zeigten die Ergebnisse, dass die Art bzw. Intensität der Strahlungsquelle bei der Immobilisierung von Biomolekülen eine entscheidende Rolle spielt. Die Belichtungen mittels DMD und CLSM führten zu größeren S/HG-Verhältnissen als die Belichtungen über Power-LED mit Lochmasken.

Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Quervernetzung von Proteinen mittels RGX, was für unterschiedliche klinische Anwendungen beispielweise in der Augenheilkunde oder Orthopädie genutzt wird. RGX kann die mechanische Stabilität von Kollagenhydrogelen erhöhen, die dann beispielsweise zur kontrollierten lokalen Wirkstofffreisetzung genutzt werden können. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden daher zunächst drei verschiedene Kollagensheets (Collagen Solutions, Viscofan, Atelocollagen) unterschiedlicher Dicken und Dichten charakterisiert und die Wirkung von RGX auf Eigenschaften wie Mikrostruktur, Quellgrad, mechanische Stabilität und Freisetzung des Antibiotikums Vancomycin untersucht. Zur Beurteilung der mechanischen Stabilität wurde die Dicke unter Krafteinfluss mit Hilfe eines Höhenmessgeräts gemessen. Darüber hinaus wurde untersucht, ob mittels RGX einzelne Schichten aus Kollagen stabil miteinander verbunden werden können. Damit sollte die Grundlage für Kollagenbiomaterialien mit maßgeschneiderten Eigenschaften, wie z.B. einer kontrollierten Freisetzung von Antibiotikum zur Vorbeugung von Entzündungen, geschaffen werden. Während es sich bei Collagen Solutions um eine dünne, flexible Kollagenfolie handelt, deren Mikrostruktur keine erkennbare Faserstruktur zeigte, besteht Viscofan aus einer sehr kompakten Struktur mit langen Fasern, die mittels mikroskopischer Analyse sichtbar waren. Atelocollagen wiederum ist ein schwammartiges unvernetztes und nach Quellung labiles Material, dessen große Poren unter dem Durchlicht- und Rasterelektronenmikroskop erkennbar waren. Die Behandlung mittels RGX hatte im Fall von Collagen Solutions lediglich einen Einfluss auf die Dicke, die bei 37 °C bei modifizierten Proben geringer war als bei unmodifzierten Proben. Im Fall von Viscofan wurden durch RGX mit 0,1 % RB und 10 min Belichtungszeit ein geringerer Quellgrad und eine geringere Dicke erhalten. Die größte Veränderung der Eigenschaften durch RGX wurde für das offene, schwammartige Atelocollagen gemessen. Bei Konzentrationen von Bengalrosa von 0,01 % bzw. 0,1 % wurde der Quellgrad im Vergleich zu unmodifizierten Proben bei 37 °C um ca. 20 % bzw. ca. 40 % reduziert. Die unter Krafteinwirkung gemessene Dicke war bei 37 °C für 0,01 % RB und 0,1 % RB im Durchschnitt 7-mal größer als die der unmodifizierten Proben. Bei Raumtemperatur betrugen die Dicken des modifizierten Atelocollagens das 27-fache der unmodifizierten Variante. Diese Ergebnisse deuteten auf eine deutliche Steigerung der mechanischen Festigkeit hin. Die Mikrostruktur-analyse ergab, dass die schwammartige Struktur nach Behandlung mittels RGX durch eine faserige Struktur ersetzt wurde. Der anfängliche Burst-Effekt während der Vancomycin-Freisetzung wurde durch die Vernetzung jedoch nicht beeinflusst. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es zudem unterschiedliche Kollagensheets mittels RGX zu Kollagenlaminaten zu verbinden. Die mechanische Charakterisierung zeigte, dass die Dicke der Laminate, bestehend aus Atelocollagen und Collagen Solutions, größer war als die Summe der Dicken der betreffenden unmodifizierten Proben. Die mechanische Stabilität von Atelocollagen konnte entsprechend durch den Verbund mit Collagen Solutions erhöht werden. Die in dieser Arbeit optimierten Parameter zur Laminatherstellung konnten bereits in Folgearbeiten angewendet und für die systematische Untersuchung der Vancomycin-Freisetzung aus Kollagenlaminaten genutzt werden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass im Handel erhältliche Kollagensheets mittels RGX vernetzt werden können, um ihre Eigenschaften anzupassen. Die größte Wirkung zeigte sich beim unvernetzten, schwammartigen Atelocollagen, das durch RGX stabilisiert wurde, was in einem reduzierten Quellungsgrad und einer erhöhten Widerstandsfähigkeit gegenüber mechanischem Druck resultierte. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass RGX zur Herstellung von Kollagenlaminaten verwendet werden kann, um Materialien mit kombinierten Eigenschaften zu schaffen. Dies macht die Modifikation und Kombination leicht verfügbarer Kollagensheets mittels RGX zu einem attraktiven Ansatz für die klinische Anwendung.

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