Die vorliegende Arbeit umfasst zwei Projekte: die Stabilisierung der F67-out Konformation von FKBP51 (FK506 bindendes Protein 51) und die Entwicklung einer Liganden-basierten Affinitäts-Chromatographie-Matrix. FKBP51 ist ein bekanntes Beispiel für eine transiente Bindungstasche, die für die Selektivität bei der Ligandenentwicklung und die Unterscheidung von strukturell ähnlichen homologen Proteinen entscheidend ist. In FKBP51 ist die transiente Bindungstasche durch das Ausklappen des Phenyl-Rests F67 aus der Bindungstasche gekennzeichnet und wird auch als F67-out-Konformation bezeichnet. Ziel war es, Proteinkonstrukte mit einer stabilisierten F67-out-Konformation zu erzeugen, um Hits in Screenings zu identifizieren, die diese spezifische Proteinkonformation binden. Durch rationales Protein-Engineering ist es gelungen, FKBP51-Varianten mit einer stabilisierten F67-out-Konformation zu erzeugen. Zu den Techniken, die zur kovalenten Fixierung der Konformation in der F67-out Konformation eingesetzt wurden, gehörten Crosslinking-Ansätze wie Photocrosslinking, Click-Chemie oder Cystein-basiertes Crosslinking sowie die chemische Proteinsynthese. Die Varianten zeigten eine verbesserte Bindungsaffinität zu einem konformationsselektiven Liganden-Tracer im Fluoreszenzpolarisations-Assay (FP-Assay), wobei die FKBP51FK1 F67C/K60C Variante mit einer Disulfidbrücke sich als die am besten geeignete Variante für ein anschließendes Fragment-Screening erwies. Die Gründe dafür sind die einfache Herstellung der Proteinvariante in hoher Menge und Reinheit, die nachgewiesene Verbesserung der Bindungsaffinität für konformationsselektive Liganden und die Möglichkeit, das Protein in seiner Apo-Form zu kristallisieren. Ein erstes fragmentbasiertes Screening mittels Thermoshift-Assay, gefolgt von einem FP-Assay, ergab vielversprechende Hits mit einer aminsubstituierten Chinolin oder Isochinolin-Kernstruktur. Dies ist der erste Schritt auf einem neuen Weg zur Identifizierung von neuen Leitstrukturen. Darüber hinaus wurde eine Liganden-basierte Affinitäts-Chromatographie-Matrix hergestellt. Dies soll ermöglichen FKBP51 aus komplexen biologischen Mischungen anzureichern sowie neue Interaktionspartner und/oder Off-Targets zu identifizieren. Dabei gelang es vier Liganden zu immobilisieren und zu testen, wobei Beladungs- und Elutionsbedingungen optimiert wurden. Zwei Systeme erwiesen sich als geeignet für die Anreicherung von FKBP51 aus komplexen biologischen Mischungen. Entweder wird SAFit1 immobilisiert und die Elution findet unter denaturierenden Bedingungen statt, oder es wird ein SAFit1- Analogon mit geringer Bindungsaffinität (hier SAFit-LA genannt) immobilisiert, so dass die Elution kompetitiv mit SAFit1 erfolgen kann.