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Characterization of new parts for synthetic biology applications in bacteria and yeast supported by automated methods

Zoll, Thomas (2023)
Characterization of new parts for synthetic biology applications in bacteria and yeast supported by automated methods.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00023130
Dissertation, Erstveröffentlichung, Verlagsversion

Kurzbeschreibung (Abstract)

The recently presented IPCC report once again urges us to intensify efforts to build a sustainable economy. The UN also emphasizes that most of the economy still operates in a linear model and urgently needs to be reformed. Biotechnological applications can offer a valuable contribution, as they can replace energyintensive processes in the chemical industry. In addition, they have the charm that the growth of the used organisms is not dependent on crude oil sources. Further, they can use inexpensive energy sources from industrial by-products as energy sources. The oil yeast Yarrowia lipolytica in particular is emerging as a valuable workhorse for industry and science. Due to the natural accumulation of lipids, the yeast represents an interesting production host for industrial applications. To date, unfortunately, only a limited repertoire of metabolic engineering approaches or SynBio circuits is available for yeast. This thesis aims, among other things, to expand the portfolio of SynBio parts for this yeast. To this end, chapter 3 presents ways to further exploit the organism. Thus, a broad-hostrange plasmid (section 3.3.1) was developed, which allows rapid testing of constructs in three organisms. This plasmid could be used to test a tetracycline aptamer in Y. lipolytica (section 3.3.2). The aptamer was previously developed for Saccharomyces cerevisiae and could be successfully used for translation inactivation. Y. lipolytica was successfully modified with a monomer of the aptamer. Unfortunately, growth assays revealedthat the strain carrying the aptamer was severely impaired in fitness. Thus, a clear conclusion about the functionality was not possible. An expansion of the repertoire of Y. lipolytica and other organisms was pursued by establishing artificial landing pads (section 3.3.3). The computer-generated DNA sequences were designed to cause as little offtarget effects as possible when using Cas9 in the organisms Bacillus subtilis, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, and Yarrowia lipolytica. To this end, up to 25 artificial protospacers were lined up in a sequence up to 900 bp long. These were successfully integrated in the genome of the organisms. Experiments with CRISPRi and CRISPRa served as proof-of-concept. By addressing different protospacers, different expression levels should be achieved depending on the distance between protospacer and reporter gene. Fine-graded activation of expression was demonstrated in S. cerevisiae. The use of CRISPRa increased the basal activity of the minimal promoter by 3.4-fold. In Y. lipolytica, there was no clear gradient as in S. cerevisiae. The effect of CRISPRi in B. subtilis was dependent on the promoter used. Automation methods were developed to support the molecular biology and microbiology work (chapter 4). Due to a clearly visible edge effect when using the incubator of the CompuGene Robotics platform, a method was developed to randomize the samples in the microtiter plates (section 4.4). Here it was shown that this method cannot eliminate the edge effect, but it can improve comparability between samples. In addition, a method was developed to use the liquid handler of the automation platform to pick colonies from agar plates (section 4.5).

Typ des Eintrags: Dissertation
Erschienen: 2023
Autor(en): Zoll, Thomas
Art des Eintrags: Erstveröffentlichung
Titel: Characterization of new parts for synthetic biology applications in bacteria and yeast supported by automated methods
Sprache: Englisch
Referenten: Kabisch, Prof. Dr. Johannes ; Süß, Prof. Dr. Beatrix
Publikationsjahr: 7 November 2023
Ort: Darmstadt
Kollation: xxi, 188 Seiten
Datum der mündlichen Prüfung: 7 Oktober 2022
DOI: 10.26083/tuprints-00023130
URL / URN: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/23130
Kurzbeschreibung (Abstract):

The recently presented IPCC report once again urges us to intensify efforts to build a sustainable economy. The UN also emphasizes that most of the economy still operates in a linear model and urgently needs to be reformed. Biotechnological applications can offer a valuable contribution, as they can replace energyintensive processes in the chemical industry. In addition, they have the charm that the growth of the used organisms is not dependent on crude oil sources. Further, they can use inexpensive energy sources from industrial by-products as energy sources. The oil yeast Yarrowia lipolytica in particular is emerging as a valuable workhorse for industry and science. Due to the natural accumulation of lipids, the yeast represents an interesting production host for industrial applications. To date, unfortunately, only a limited repertoire of metabolic engineering approaches or SynBio circuits is available for yeast. This thesis aims, among other things, to expand the portfolio of SynBio parts for this yeast. To this end, chapter 3 presents ways to further exploit the organism. Thus, a broad-hostrange plasmid (section 3.3.1) was developed, which allows rapid testing of constructs in three organisms. This plasmid could be used to test a tetracycline aptamer in Y. lipolytica (section 3.3.2). The aptamer was previously developed for Saccharomyces cerevisiae and could be successfully used for translation inactivation. Y. lipolytica was successfully modified with a monomer of the aptamer. Unfortunately, growth assays revealedthat the strain carrying the aptamer was severely impaired in fitness. Thus, a clear conclusion about the functionality was not possible. An expansion of the repertoire of Y. lipolytica and other organisms was pursued by establishing artificial landing pads (section 3.3.3). The computer-generated DNA sequences were designed to cause as little offtarget effects as possible when using Cas9 in the organisms Bacillus subtilis, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, and Yarrowia lipolytica. To this end, up to 25 artificial protospacers were lined up in a sequence up to 900 bp long. These were successfully integrated in the genome of the organisms. Experiments with CRISPRi and CRISPRa served as proof-of-concept. By addressing different protospacers, different expression levels should be achieved depending on the distance between protospacer and reporter gene. Fine-graded activation of expression was demonstrated in S. cerevisiae. The use of CRISPRa increased the basal activity of the minimal promoter by 3.4-fold. In Y. lipolytica, there was no clear gradient as in S. cerevisiae. The effect of CRISPRi in B. subtilis was dependent on the promoter used. Automation methods were developed to support the molecular biology and microbiology work (chapter 4). Due to a clearly visible edge effect when using the incubator of the CompuGene Robotics platform, a method was developed to randomize the samples in the microtiter plates (section 4.4). Here it was shown that this method cannot eliminate the edge effect, but it can improve comparability between samples. In addition, a method was developed to use the liquid handler of the automation platform to pick colonies from agar plates (section 4.5).

Alternatives oder übersetztes Abstract:
Alternatives AbstractSprache

Der kürzlich vorgestellte IPCC Bericht mahnt uns erneut zu einer Verstärkung der Ambitionen, eine nachhaltige Wirtschaft aufzubauen. Auch die UN betonen, dass der größte Teil der Wirtschaft noch nach einem linearen Modell funktioniert und dringend reformiert werden muss. Einen wertvollen Beitrag können biotechnologische Anwendungen leisten, da sie energieintensive Prozesse der chemischen Industrie ersetzen können. Zusätzlich haben sie den Charme, dass die eingesetzten Organismen nicht auf Erdölerzeugnisse angewiesen sind, sondern kostengünstige Energieträger aus industriellen Nebenerzeugnissen als Energiequelle nutzen können. Besonders die Ölhefe Yarrowia lipolytica entwickelt sich zu einem wertvollen Arbeitstier für die Industrie aber auch für die Wissenschaft. Leider steht für die Hefe bisher nur ein begrenztes Repertoire für das Metabolic Engineering oder für den Aufbau von Schaltkreisen in der synthetischen Biologie zur Verfügung. Durch die natürliche Anreicherung von Lipiden stellt die Hefe einen interessanten Produktionsorganismus für die Industrie dar. Diese Arbeit zielt unter anderem darauf ab, das Portfolio an SynBio Parts für diese Hefe zu erweitern. Dazu werden in chapter 3 Möglichkeiten vorgestellt, den Organismus weiter zu erschließen. So konnte eine Multiorganismen-Plasmid (section 3.3.1) entwickelt werden, das das schnelle Testen von Konstrukten in drei Organismen ermöglicht. Dieses Plasmid konnte dazu eingesetzte werden, ein Tetracycline Aptamer in Y. lipolytica zu testen (section 3.3.2). Das Aptamer wurde zuvor für Saccharomyces cerevisiae entwickelt und konnte dort erfolgreich für die Abschaltung der Translation verwendet werden. Y. lipolytica konnte erfolgreich mit einem Monomer des Aptamers modifiziert werden. Bedauerlicherweise war der Stamm, der das Aptamer trug, deutlich in ihrer Fitness beeinträchtigt. Dadurch war eine eindeutige Aussage, über die Funktionalität nicht möglich. Eine Erweiterung des Repertoires für Y. lipolytica und andere Organismen wurde durch die Etablierung von artifiziellen Landing-Pads verfolgt (section 3.3.3). Die Computer-generierten DNA-Sequenzen wurden so generiert, dass sie in den Organismen Bacillus subtilis, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae und Yarrowia lipolytica möglichst wenig Off-Target Effekte beim Einsatz von Cas9 hervorrufen. Dazu wurden in einer bis zu 900 bp langen Sequenz bis zu 25 artifizielle Protospacer aufgereiht. Diese konnten erfolgreich in das Genom der Organismen integriert werden. Als Proof-of-Concept dienten Versuche mit CRISPRi und CRISPRa, sodass durch die Adressierung unterschiedlicher Protospacer eine abgestufte Expressionsstärke erreicht wird, die sich nach dem Abstand zwischen Protospacer und Reportergen richtet. Eine fein abgestufte Aktivierung der Expression konnte in S. cerevisiae gezeigt werden. Durch den Einsatz von CRISPRa konnte die Basalaktivität des Minimalpromotors um das 3.4-fache gesteigert werden. In Y. lipolytica gab es keinen klaren Gradienten, wie in S. cerevisiae. Der Effekt von CRISPRi in B. subtilis war abhängig vom eingesetzten Promotor. Zur Unterstützung der molekularbiologischen und mikrobiologischen Arbeiten wurden Methoden zur Automation entwickelt (chapter 4). Durch einen klar erkennbaren „Edge-Effekt“ bei der Nutzung des Inkubators der CompuGene Robotics Plattform, wurde eine Methode entwickelt, die die Proben in den Mikrotiterplatten zufällig verteilt (section 4.4). Diese Methode kann zwar nicht den Randeffekt unterbinden, kann aber die Vergleichbarkeit zwischen den Proben verbessern. Außerdem konnte eine Möglichkeit entwickelt werden, um den Pipettierroboter aus der Automationsanlage zum Picken von Kolonien zu verwenden (section 4.5).

Deutsch
Status: Verlagsversion
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-231307
Sachgruppe der Dewey Dezimalklassifikatin (DDC): 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Fachbereich(e)/-gebiet(e): 10 Fachbereich Biologie
10 Fachbereich Biologie > Computer-aided Synthetic Biology
Hinterlegungsdatum: 07 Nov 2023 15:21
Letzte Änderung: 08 Nov 2023 05:57
PPN:
Referenten: Kabisch, Prof. Dr. Johannes ; Süß, Prof. Dr. Beatrix
Datum der mündlichen Prüfung / Verteidigung / mdl. Prüfung: 7 Oktober 2022
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