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Interplay of DNA replication, repair and chromatin: structure versus function

Mamberti, Stefania (2023)
Interplay of DNA replication, repair and chromatin: structure versus function.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00023039
Dissertation, Erstveröffentlichung, Verlagsversion

Kurzbeschreibung (Abstract)

Hierarchical levels of chromatin organization allow different genomic functions to be spatio-temporally regulated within mammalian nuclei. Both DNA replication and DNA repair are global genomic processes. Their chromatin units have remarkable structural similarities and microscopically appear as clusters of nanofocal structures, each in the size range of chromatin loops. The present work aimed at relating genomic functions with the underlying structural organization by the two chromatin architectural proteins CTCF and cohesin, which cooperate to shape the genome into chromatin loops and domains. Here, CTCF was shown to be critical for cellular survival after ionizing irradiation in a CTCF-dose dependent way. The results obtained in different cell lines upon CTCF-depletion were integrated into a biophysical model. The decreased clonogenic potential showed to derive from the increased probability of double strand breaks to cluster in larger chromatin domains lacking CTCF at their borders. Moreover, CTCF proved to be enriched at the sites and at the time of DNA replication. CTCF intensity within replication foci was shown to decrease over a chase time after replication labeling, suggesting the occurrence of CTCF accumulation during ongoing DNA replication. The depletion of CTCF correlated with an impairment in cell cycle progression. CTCF-depleted cells stalled in G1 in a CTCF-dose dependent way, indicating that the chromatin structure provided by CTCF might be needed to properly enter S-phase. Additionally, CTCF resulted to be particularly enriched at the replicating inactive X and Y chromosomes. The depletion of CTCF led to the loss of synchrony in the DNA replication of the Y chromosome. Additionally, Y chromosome architecture showed changes of volume and shape upon CTCF reduction. In the second part of this work, the cohesin subunit RAD21 was shown essential to determine the structure of chromatin loops. RAD21-depleted cells exhibited an increase in the size and shape heterogeneity of chromatin loops. The cohesin component SA1 was investigated for a role in DNA damage signaling. SA1 KO cells showed an impairment of the γH2AX foci at all tested X-ray doses. The repair functional units decreased in number, volume and intensity in the absence of SA1. In conclusion, the results presented here led to propose that the functions of DNA replication and repair are determined by the chromatin architecture, with the structure dictating the function. Future work should further investigate the mechanisms behind the regulation of global genomic functions by these two chromatin architectural proteins and define the precise interplay between cohesin and CTCF within such regulation.

Typ des Eintrags: Dissertation
Erschienen: 2023
Autor(en): Mamberti, Stefania
Art des Eintrags: Erstveröffentlichung
Titel: Interplay of DNA replication, repair and chromatin: structure versus function
Sprache: Englisch
Referenten: Cardoso, Prof. Dr. M. Cristina ; Jakob, Prof. Dr. Burkhard
Publikationsjahr: 23 Oktober 2023
Ort: Darmstadt
Kollation: xii, 181 Seiten
Datum der mündlichen Prüfung: 13 Dezember 2022
DOI: 10.26083/tuprints-00023039
URL / URN: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/23039
Kurzbeschreibung (Abstract):

Hierarchical levels of chromatin organization allow different genomic functions to be spatio-temporally regulated within mammalian nuclei. Both DNA replication and DNA repair are global genomic processes. Their chromatin units have remarkable structural similarities and microscopically appear as clusters of nanofocal structures, each in the size range of chromatin loops. The present work aimed at relating genomic functions with the underlying structural organization by the two chromatin architectural proteins CTCF and cohesin, which cooperate to shape the genome into chromatin loops and domains. Here, CTCF was shown to be critical for cellular survival after ionizing irradiation in a CTCF-dose dependent way. The results obtained in different cell lines upon CTCF-depletion were integrated into a biophysical model. The decreased clonogenic potential showed to derive from the increased probability of double strand breaks to cluster in larger chromatin domains lacking CTCF at their borders. Moreover, CTCF proved to be enriched at the sites and at the time of DNA replication. CTCF intensity within replication foci was shown to decrease over a chase time after replication labeling, suggesting the occurrence of CTCF accumulation during ongoing DNA replication. The depletion of CTCF correlated with an impairment in cell cycle progression. CTCF-depleted cells stalled in G1 in a CTCF-dose dependent way, indicating that the chromatin structure provided by CTCF might be needed to properly enter S-phase. Additionally, CTCF resulted to be particularly enriched at the replicating inactive X and Y chromosomes. The depletion of CTCF led to the loss of synchrony in the DNA replication of the Y chromosome. Additionally, Y chromosome architecture showed changes of volume and shape upon CTCF reduction. In the second part of this work, the cohesin subunit RAD21 was shown essential to determine the structure of chromatin loops. RAD21-depleted cells exhibited an increase in the size and shape heterogeneity of chromatin loops. The cohesin component SA1 was investigated for a role in DNA damage signaling. SA1 KO cells showed an impairment of the γH2AX foci at all tested X-ray doses. The repair functional units decreased in number, volume and intensity in the absence of SA1. In conclusion, the results presented here led to propose that the functions of DNA replication and repair are determined by the chromatin architecture, with the structure dictating the function. Future work should further investigate the mechanisms behind the regulation of global genomic functions by these two chromatin architectural proteins and define the precise interplay between cohesin and CTCF within such regulation.

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Hierarchische Ebenen der Chromatinorganisation ermöglichen die räumlich-zeitliche Regulation verschiedener genomischer Funktionen in den Zellkernen von Säugetieren. Sowohl die DNA-Replikation als auch die DNA-Reparatur sind globale genomische Prozesse. Ihre Chromatineinheiten weisen bemerkenswerte strukturelle Ähnlichkeiten auf und erscheinen mikroskopisch als Cluster von nanofokalen Strukturen, die jeweils in der Größenordnung von Chromatinschleifen liegen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Genomfunktionen mit der zugrundeliegenden strukturellen Organisation durch die beiden Chromatinarchitekturproteine CTCF und Cohesin in Beziehung zu setzen, die zusammenarbeiten, um das Genom in Chromatinschleifen und Domänen zu formen. Hier wurde gezeigt, dass CTCF dosisabhängig für das zelluläre Überleben nach ionisierender Bestrahlung entscheidend ist. Die Ergebnisse der CTCF-Depletion in verschiedenen Zelllinien wurden in ein biophysikalisches Modell integriert. Es zeigte sich, dass das verringerte klonogene Potenzial auf die erhöhte Wahrscheinlichkeit von DNA-Doppelstrangbrüchen zurückzuführen ist, die sich in größeren Chromatindomänen ohne CTCF an deren Rändern zusammenballen. Außerdem erwies sich CTCF an den Stellen und zum Zeitpunkt der DNA-Replikation als angereichert. Es zeigte sich, dass die CTCF-Intensität innerhalb von Replikations-Foci nach der Replikationsmarkierung über eine Verfolgungszeit abnimmt, was auf eine CTCF-Akkumulation während der laufenden DNA-Replikation hindeutet. Die Verringerung von CTCF korrelierte mit einer Beeinträchtigung der Zellzyklusprogression. CTCF-depletierte Zellen verharrten CTCF-dosisabhängig in der G1 Phase, was darauf hindeutet, dass die von CTCF bereitgestellte Chromatinstruktur für den korrekten Eintritt in die S-Phase erforderlich sein könnte. Außerdem erwies sich CTCF als besonders angereichert an den replizierenden inaktiven X- und Y-Chromosomen. Die Verminderung von CTCF führte zu einem Verlust der Synchronität bei der DNA-Replikation des Y-Chromosoms. Außerdem veränderte sich die Architektur des Y-Chromosoms durch die Verringerung von CTCF in Bezug auf Volumen und Form. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Cohesin-Untereinheit RAD21 für die Struktur der Chromatinschleifen entscheidend ist. RAD21-depletierte Zellen wiesen eine Zunahme der Größe und Formheterogenität von Chromatinschleifen auf. Die Cohesin-Komponente SA1 wurde auf ihre Rolle bei der Signalisierung von DNA-Schäden untersucht. SA1 KO-Zellen zeigten bei allen getesteten Röntgendosen eine Beeinträchtigung von γH2AX. Die funktionalen Reparatureinheiten nahmen in Abwesenheit von SA1 in Anzahl, Volumen und Intensität ab. Die hier vorgestellten Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die Funktion der DNA-Replikation und -Reparatur durch die Chromatinarchitektur bestimmt wird, wobei die Struktur die Funktion bestimmt. Zukünftige Arbeiten sollten die Mechanismen hinter der Regulierung globaler genomischer Funktionen durch diese beiden Proteine der Chromatinarchitektur weiter untersuchen und das genaue Zusammenspiel zwischen Cohesin und CTCF innerhalb dieser Regulierung definieren.

Deutsch
Status: Verlagsversion
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-230395
Sachgruppe der Dewey Dezimalklassifikatin (DDC): 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Fachbereich(e)/-gebiet(e): 10 Fachbereich Biologie
10 Fachbereich Biologie > Cell Biology and Epigenetics
Hinterlegungsdatum: 23 Okt 2023 12:10
Letzte Änderung: 24 Okt 2023 05:04
PPN:
Referenten: Cardoso, Prof. Dr. M. Cristina ; Jakob, Prof. Dr. Burkhard
Datum der mündlichen Prüfung / Verteidigung / mdl. Prüfung: 13 Dezember 2022
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