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HCN4 pacemaker channels as potential therapeutic targets based on their novel structural properties

Sharifzadeh, Atiyehsadat (2023)
HCN4 pacemaker channels as potential therapeutic targets based on their novel structural properties.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00024625
Dissertation, Erstveröffentlichung, Verlagsversion

Kurzbeschreibung (Abstract)

Over the past few years, single particle cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has made impressive impacts on the research field of structural biology of large eukaryotic membrane proteins. These are, indeed, challenging proteins for structural biology as they have a low yield of expression and thus purification. Their low purification yield originates from the fact that they require an expression in complex cell systems, such as mammalian cell lines. These systems provide them with the suitable physiological environment for their proper maturation but limit their over-expression. This makes them generally not suitable for classical methods of structural biology such as X-ray and NMR. But in the advent of improved cryo-EM methods it turned out that even a small amount of pure protein may often be sufficient for structural studies with this new technology. In this context, the present PhD thesis is focused on setting the procedure for the expression and for the subsequent purification of a large eukaryotic protein in mammalian HEK293F. The purified protein of interest, the Hyperpolarization activated and Cyclic Nucleotide regulated (HCN4) pacemaker channel, was eventually used to obtain high resolution structures of the channel in the open and closed state by cryo-EM. This allowed to unravel the structural determinants of key phenomena of HCN channel function such as gating/ion permeation, and the HCN4 specific cyclic nucleotide-dependent modulation. Furthermore, the protocol of HCN4 purification that I have set here has also opened in combination with the structural information the possibility of performing biochemical studies with the full-length protein. This led to the identification and characterization of drugs, which can modulate HCN function in an isoform specific manner. Here I show the successful use of purified HCN4 to detect and quantify ligand binding with molecules whose interaction with the channel protein was so far impossible with classical biochemistry. The most important outcome of this work is the use of purified HCN4 as a bait in a yeast displayed nanobody library. This screening endeavour resulted in the discovery of new nanobodies, which can modulate with high affinity HCN channel function in an isoform specific manner. This may eventually lead to the first HCN4 specific drug for targeting cardiac arrhythmias related to the malfunction of this pacemaker channel.

Typ des Eintrags: Dissertation
Erschienen: 2023
Autor(en): Sharifzadeh, Atiyehsadat
Art des Eintrags: Erstveröffentlichung
Titel: HCN4 pacemaker channels as potential therapeutic targets based on their novel structural properties
Sprache: Englisch
Referenten: Thiel, Prof. Dr. Gerhard ; Moroni, Prof. Dr. Anna
Publikationsjahr: 4 Oktober 2023
Ort: Darmstadt
Kollation: 120 Seiten
Datum der mündlichen Prüfung: 24 April 2023
DOI: 10.26083/tuprints-00024625
URL / URN: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/24625
Kurzbeschreibung (Abstract):

Over the past few years, single particle cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has made impressive impacts on the research field of structural biology of large eukaryotic membrane proteins. These are, indeed, challenging proteins for structural biology as they have a low yield of expression and thus purification. Their low purification yield originates from the fact that they require an expression in complex cell systems, such as mammalian cell lines. These systems provide them with the suitable physiological environment for their proper maturation but limit their over-expression. This makes them generally not suitable for classical methods of structural biology such as X-ray and NMR. But in the advent of improved cryo-EM methods it turned out that even a small amount of pure protein may often be sufficient for structural studies with this new technology. In this context, the present PhD thesis is focused on setting the procedure for the expression and for the subsequent purification of a large eukaryotic protein in mammalian HEK293F. The purified protein of interest, the Hyperpolarization activated and Cyclic Nucleotide regulated (HCN4) pacemaker channel, was eventually used to obtain high resolution structures of the channel in the open and closed state by cryo-EM. This allowed to unravel the structural determinants of key phenomena of HCN channel function such as gating/ion permeation, and the HCN4 specific cyclic nucleotide-dependent modulation. Furthermore, the protocol of HCN4 purification that I have set here has also opened in combination with the structural information the possibility of performing biochemical studies with the full-length protein. This led to the identification and characterization of drugs, which can modulate HCN function in an isoform specific manner. Here I show the successful use of purified HCN4 to detect and quantify ligand binding with molecules whose interaction with the channel protein was so far impossible with classical biochemistry. The most important outcome of this work is the use of purified HCN4 as a bait in a yeast displayed nanobody library. This screening endeavour resulted in the discovery of new nanobodies, which can modulate with high affinity HCN channel function in an isoform specific manner. This may eventually lead to the first HCN4 specific drug for targeting cardiac arrhythmias related to the malfunction of this pacemaker channel.

Alternatives oder übersetztes Abstract:
Alternatives AbstractSprache

In den letzten Jahren hat vor allem die Einzelpartikel-Tieftemperatur-Elektronenmikroskopie (cryo-EM) erheblichen Einfluss auf die Strukturbiologie von großen Membranproteinen aus Eukaryoten gewonnen. Die entsprechenden Proteine sind vor allem wegen ihrer geringen Ausbeute in der Expression und der folgenden Aufreinigung eine große Herausforderung für Strukturbiologen. Die geringe Ausbeute bei der Proteinreinigung ist in der Regel darauf zurückzuführen, dass die Proteine in komplexen Zellsystemen, z. B. Säugerzellen, exprimiert werden müssen. Während diese Systeme eine geeignete physiologische Umgebung für die korrekte Faltung der Proteine ermöglichen, sind sie andererseits für die geringe Ausbeute verantwortlich. Aus den genannten Gründen sind großen Membranproteinen meist nicht zugänglich für klassische Methoden der Strukturbiologie wie Röntgen-Kristallographie oder NMR. Im Rahmen, der sich ständig verbessernden Methoden in der cryo-EM Technik hat sich jedoch herausgestellt, dass mit dieser Technik selbst geringe Mengen an gereinigtem Protein ausreichen können, um Strukturstudien durch führen zu können. In diesem Kontext beschäftigt sich die vorliege Arbeit mit der Ausarbeitung von Protokollen, die eine Expression mit folgender Aufreinigung von einem großen eukaryotischen Membranprotein in der Säugerzelllinie HEK293F ermöglichen. Die Aufreinigung des Proteins von Interesse, der hyperpolarization activated and cyclic nucleotide regulated (HCN4) Schrittmacherkanal, wurde in Folge genutzt, um mittels cryoEM hochauflösenden Strukturen des Kanals im offenen und geschlossenen Zustand zu gewinnen. Dies eröffnete Einblicke in die strukturellen Besonderheiten des Proteins, die die funktionellen Eigenarten von HCN Kanälen wie Kanalschalten / Ionendurchtritt und die HCN4 spezifische Modulation durch zyklische Nukeleotide, erklären. Das Protokoll zur Aufreinigung von HCN4, das ich hier etabliert habe, erlaubte in Kombination mit den Strukturdaten, ebenfalls die Möglichkeit biochemische Experimente mit dem Volllängenprotein durchzuführen. Diese haben zur Identifizierung und Charakterisierung von Wirkstoffen geführt, die in der Lage sind, die Funktion der HCN Kanäle in einer Isoform-spezifischen Weise zu modulieren. Ich präsentiere hier den erfolgreichen Einsatz von gereinigtem HCN4 zur Detektion und Quantifizierung von Liganden-Bindung mit Wirkmolekülen, die bisher mit konventionellen Methoden nicht möglich war. Das wichtigste Ergebnis aus dieser Arbeit ist die Nutzung von gereinigtem HCN4 Protein als Köder zum Durchmustern einer Hefe Nanobody display Bibliothek. Diese Durchmusterung führte zur Isolation eines neuen Antikörpers, der in der Lage ist, mit hoher Affinität die Funktion des Kanals in einer Isoform-spezifischen Weise zu modulieren. Daraus resultiert die Entwicklung des ersten HCN4 spezifischen Wirkstoffes, der das Potential hat um in Zukunft eingesetzt zu werden, um Herzrhythmusstörungen, die auf einer Fehlfunktion dieses Kanals beruhen, zu korrigieren.

Deutsch
Status: Verlagsversion
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-246254
Sachgruppe der Dewey Dezimalklassifikatin (DDC): 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Fachbereich(e)/-gebiet(e): 10 Fachbereich Biologie
10 Fachbereich Biologie > Plant Membrane Biophyscis (am 20.12.23 umbenannt in Biologie der Algen und Protozoen)
Hinterlegungsdatum: 04 Okt 2023 11:05
Letzte Änderung: 05 Okt 2023 08:23
PPN:
Referenten: Thiel, Prof. Dr. Gerhard ; Moroni, Prof. Dr. Anna
Datum der mündlichen Prüfung / Verteidigung / mdl. Prüfung: 24 April 2023
Export:
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