In den letzten Jahren hat vor allem die Einzelpartikel-Tieftemperatur-Elektronenmikroskopie (cryo-EM) erheblichen Einfluss auf die Strukturbiologie von großen Membranproteinen aus Eukaryoten gewonnen. Die entsprechenden Proteine sind vor allem wegen ihrer geringen Ausbeute in der Expression und der folgenden Aufreinigung eine große Herausforderung für Strukturbiologen. Die geringe Ausbeute bei der Proteinreinigung ist in der Regel darauf zurückzuführen, dass die Proteine in komplexen Zellsystemen, z. B. Säugerzellen, exprimiert werden müssen. Während diese Systeme eine geeignete physiologische Umgebung für die korrekte Faltung der Proteine ermöglichen, sind sie andererseits für die geringe Ausbeute verantwortlich. Aus den genannten Gründen sind großen Membranproteinen meist nicht zugänglich für klassische Methoden der Strukturbiologie wie Röntgen-Kristallographie oder NMR. Im Rahmen, der sich ständig verbessernden Methoden in der cryo-EM Technik hat sich jedoch herausgestellt, dass mit dieser Technik selbst geringe Mengen an gereinigtem Protein ausreichen können, um Strukturstudien durch führen zu können. In diesem Kontext beschäftigt sich die vorliege Arbeit mit der Ausarbeitung von Protokollen, die eine Expression mit folgender Aufreinigung von einem großen eukaryotischen Membranprotein in der Säugerzelllinie HEK293F ermöglichen. Die Aufreinigung des Proteins von Interesse, der hyperpolarization activated and cyclic nucleotide regulated (HCN4) Schrittmacherkanal, wurde in Folge genutzt, um mittels cryoEM hochauflösenden Strukturen des Kanals im offenen und geschlossenen Zustand zu gewinnen. Dies eröffnete Einblicke in die strukturellen Besonderheiten des Proteins, die die funktionellen Eigenarten von HCN Kanälen wie Kanalschalten / Ionendurchtritt und die HCN4 spezifische Modulation durch zyklische Nukeleotide, erklären. Das Protokoll zur Aufreinigung von HCN4, das ich hier etabliert habe, erlaubte in Kombination mit den Strukturdaten, ebenfalls die Möglichkeit biochemische Experimente mit dem Volllängenprotein durchzuführen. Diese haben zur Identifizierung und Charakterisierung von Wirkstoffen geführt, die in der Lage sind, die Funktion der HCN Kanäle in einer Isoform-spezifischen Weise zu modulieren. Ich präsentiere hier den erfolgreichen Einsatz von gereinigtem HCN4 zur Detektion und Quantifizierung von Liganden-Bindung mit Wirkmolekülen, die bisher mit konventionellen Methoden nicht möglich war. Das wichtigste Ergebnis aus dieser Arbeit ist die Nutzung von gereinigtem HCN4 Protein als Köder zum Durchmustern einer Hefe Nanobody display Bibliothek. Diese Durchmusterung führte zur Isolation eines neuen Antikörpers, der in der Lage ist, mit hoher Affinität die Funktion des Kanals in einer Isoform-spezifischen Weise zu modulieren. Daraus resultiert die Entwicklung des ersten HCN4 spezifischen Wirkstoffes, der das Potential hat um in Zukunft eingesetzt zu werden, um Herzrhythmusstörungen, die auf einer Fehlfunktion dieses Kanals beruhen, zu korrigieren.