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Flavors of biotin ligases: From research tools towards biopharmaceutical applications

Bitsch, Sebastian Harald (2023)
Flavors of biotin ligases: From research tools towards biopharmaceutical applications.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00024206
Dissertation, Erstveröffentlichung, Verlagsversion

Kurzbeschreibung (Abstract)

Biotin ligases are enzymes commonly attaching biotin to biotin-dependent enzymes, which are fundamental for essential metabolic pathways like gluconeogenesis or fatty acids synthesis. However, in times of protein engineering and genome editing those enzymes can be utilized in versatile ways. In this work biotin ligases were deployed in different fields of research starting with a tool for fundamental understanding of cell biology and culminating in biopharmaceutical approaches. First, a novel enzyme called ultraID applicable for protein-protein interaction studies was engineered by directed evolution. This undertaking was carried out by error-prone PCR mutagenesis and yeast surface display in combination with fluorescence activated cell sorting. While based on a biotin ligase derived from Aquifex aeolicus the novel enzyme exhibited a massively improved catalytic turnover, which was tracked back to one single mutation in the active site. To date, ultraID is one of the smallest and most efficient enzymes for the proximity-dependent biotin identification method. Second, screening of the randomized biotin ligase library was conducted towards a modified biotin substrate. Hereby, a propargyl functionalized biotin derivative was examined for enzyme turnover. Even tough different yeast surface presentation and assay strategies were analyzed a propargyl biotin using enzymes was not identified. Third, fundamental experiments for the generation of an antibody-drug conjugate by biotin ligases were performed. A biotin ligase derived from Pyrococcus horikoshii was exploited to conjugate propargyl biotin and desthiobiotin azide to the therapeutic antibody trastuzumab, which was equipped with a biotin acceptor domain. It was successfully demonstrated that chemoenzymatic modification was feasible by conjugating a fluorophore to the antibody. However, the usage of desthiobiotin azide as a substrate renders the biotin ligase unspecific and consequently, optimizations must be done in future approaches. In parallel an antibody-drug conjugate was generated by a different approach. Lipoate-protein ligase A derived from Escherichia coli was used to conjugate a click chemistry moiety to a tagged trastuzumab. Subsequent attachment of a Monomethyl auristatin E toxin led to the generation of an antibody-drug conjugate with potency in the picomolar range. Additionally, it was shown that the applied conjugation strategy had no impact on the antibodies affinity and enzymatic conjugation was complete within a few minutes. Last, identification of internalizing single-chain variable fragments out of systemic lupus erythematosus phage display library was executed. Hereby different enrichment strategies were examined involving incubation on mammalian cells and biotinylation of phages upon successful cell penetration. Ultimately, discovery of an internalizing binder was not achieved but crucial knowledge on phage display-based enrichment of cell penetrating binders was obtained.

Typ des Eintrags: Dissertation
Erschienen: 2023
Autor(en): Bitsch, Sebastian Harald
Art des Eintrags: Erstveröffentlichung
Titel: Flavors of biotin ligases: From research tools towards biopharmaceutical applications
Sprache: Englisch
Referenten: Kolmar, Prof. Dr. Harald ; Stein, Prof. Dr. Viktor
Publikationsjahr: 2023
Ort: Darmstadt
Kollation: ix, 127, XXII
Datum der mündlichen Prüfung: 26 Juni 2023
DOI: 10.26083/tuprints-00024206
URL / URN: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/24206
Kurzbeschreibung (Abstract):

Biotin ligases are enzymes commonly attaching biotin to biotin-dependent enzymes, which are fundamental for essential metabolic pathways like gluconeogenesis or fatty acids synthesis. However, in times of protein engineering and genome editing those enzymes can be utilized in versatile ways. In this work biotin ligases were deployed in different fields of research starting with a tool for fundamental understanding of cell biology and culminating in biopharmaceutical approaches. First, a novel enzyme called ultraID applicable for protein-protein interaction studies was engineered by directed evolution. This undertaking was carried out by error-prone PCR mutagenesis and yeast surface display in combination with fluorescence activated cell sorting. While based on a biotin ligase derived from Aquifex aeolicus the novel enzyme exhibited a massively improved catalytic turnover, which was tracked back to one single mutation in the active site. To date, ultraID is one of the smallest and most efficient enzymes for the proximity-dependent biotin identification method. Second, screening of the randomized biotin ligase library was conducted towards a modified biotin substrate. Hereby, a propargyl functionalized biotin derivative was examined for enzyme turnover. Even tough different yeast surface presentation and assay strategies were analyzed a propargyl biotin using enzymes was not identified. Third, fundamental experiments for the generation of an antibody-drug conjugate by biotin ligases were performed. A biotin ligase derived from Pyrococcus horikoshii was exploited to conjugate propargyl biotin and desthiobiotin azide to the therapeutic antibody trastuzumab, which was equipped with a biotin acceptor domain. It was successfully demonstrated that chemoenzymatic modification was feasible by conjugating a fluorophore to the antibody. However, the usage of desthiobiotin azide as a substrate renders the biotin ligase unspecific and consequently, optimizations must be done in future approaches. In parallel an antibody-drug conjugate was generated by a different approach. Lipoate-protein ligase A derived from Escherichia coli was used to conjugate a click chemistry moiety to a tagged trastuzumab. Subsequent attachment of a Monomethyl auristatin E toxin led to the generation of an antibody-drug conjugate with potency in the picomolar range. Additionally, it was shown that the applied conjugation strategy had no impact on the antibodies affinity and enzymatic conjugation was complete within a few minutes. Last, identification of internalizing single-chain variable fragments out of systemic lupus erythematosus phage display library was executed. Hereby different enrichment strategies were examined involving incubation on mammalian cells and biotinylation of phages upon successful cell penetration. Ultimately, discovery of an internalizing binder was not achieved but crucial knowledge on phage display-based enrichment of cell penetrating binders was obtained.

Alternatives oder übersetztes Abstract:
Alternatives AbstractSprache

Biotin-Ligasen sind Enzyme, die den Biotin-Transfer auf Biotin-abhängige Enzyme katalysieren, welche wiederum für essenzielle Stoffwechselwege wie die Gluconeogenese oder die Fettsäuresynthese von grundlegender Bedeutung sind. In Zeiten des Protein-Engineerings und Genome Editings können diese Enzyme jedoch auch auf andere, vielfältige Weise genutzt werden. In dieser Arbeit wurden Biotin-Ligasen für verschiedene Anwendungen eingesetzt, angefangen als Hilfsmittel zum grundlegenden Verständnis der Zellbiologie bis hin zu biopharmazeutischen Ansätzen. Zunächst wurde durch gerichtete Evolution ein neuartiges Enzym namens ultraID für Protein-Protein-Interaktionsstudien entwickelt. Dieses Unterfangen wurde durch Error-Prone PCR Mutagenese und Yeast Surface Display in Kombination mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung realisiert. Das identifizierte Enzym, das auf einer Biotin-Ligase aus Aquifex aeolicus basiert, wies einen massiv verbesserten katalytischen Umsatz auf, der auf eine einzige Mutation im aktiven Zentrum zurückgeführt werden konnte. Bislang ist ultraID eines der kleinsten und effizientesten Enzyme für die proximity-dependent biotin identification Methode. Als nächstes wurde die randomisierte Biotin-Ligasen Bibliothek auf ein modifiziertes Biotin Substrat durchmustert. Dabei wurde ein Propargyl-funktionalisiertes Biotin Derivat auf Enzymumsatz untersucht. Trotz der Anwendung verschiedener Präsentations- und Assay-Strategien konnte ein Propargyl-Biotin umsetzendes Enzym nicht identifiziert werden. Darüber hinaus wurden grundlegende Experimente zur Herstellung eines Antikörper-Wirkstoff-Konjugats durch Biotin-Ligasen durchgeführt. Eine aus Pyrococcus horikoshii stammende Biotin-Ligase wurde genutzt, um Propargyl-Biotin und Desthiobiotin-Azid an den therapeutischen Antikörper Trastuzumab zu konjugieren, der zuvor mit einer Biotin-Akzeptordomäne ausgestattet wurde. Es konnte erfolgreich gezeigt werden, dass eine chemoenzymatische Modifizierung durch Konjugation eines Fluorophors an den Antikörper möglich ist. Die Verwendung von Desthiobiotin-Azid als Substrat machte die Biotin-Ligase jedoch unspezifisch, sodass bei zukünftigen Ansätzen Optimierungen vorgenommen werden müssen. Parallel dazu wurde ein Antikörper-Wirkstoff-Konjugat mit einer anderen Konjugationsstrategie hergestellt. Die Liponsäure-Ligase A aus Escherichia coli wurde zum Anbringen eines Click-Chemie kompatiblen Moleküls an einen mit Enzym-Erkennungsmotiv modifizierten Trastuzumab verwendet. Das anschließende Funktionalisieren mit einem Monomethyl-Auristatin-E Toxin führte zur Herstellung eines Antikörper-Wirkstoff-Konjugats mit einer Wirksamkeit im picomolaren Bereich. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die angewandte Konjugationsstrategie keinen Einfluss auf die Affinität des Antikörpers hatte und die enzymatische Modifizierung innerhalb weniger Minuten abgeschlossen war. Zuletzt wurde die Identifizierung von internalisierenden single-chain variable fragments aus Phagen-Display-Bibliotheken von Patienten, welche an systemischem Lupus erythematodes leiden, durchgeführt. Dabei wurden verschiedene Anreicherungsstrategien untersucht, die eine Inkubation auf Säugetierzellen und eine Biotinylierung der Phagen nach erfolgreicher Zellpenetration beinhalteten. Letztendlich konnte kein internalisierender Binder gefunden werden, aber es wurden wichtige Erkenntnisse über die Anreicherung von zellpenetrierenden Bindern mittels Phagen-Display gewonnen.

Deutsch
Status: Verlagsversion
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-242067
Sachgruppe der Dewey Dezimalklassifikatin (DDC): 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
Fachbereich(e)/-gebiet(e): 07 Fachbereich Chemie
07 Fachbereich Chemie > Clemens-Schöpf-Institut > Fachgebiet Biochemie
07 Fachbereich Chemie > Clemens-Schöpf-Institut > Fachgebiet Biochemie > Allgemeine Biochemie
Hinterlegungsdatum: 05 Jul 2023 12:03
Letzte Änderung: 06 Jul 2023 05:27
PPN:
Referenten: Kolmar, Prof. Dr. Harald ; Stein, Prof. Dr. Viktor
Datum der mündlichen Prüfung / Verteidigung / mdl. Prüfung: 26 Juni 2023
Export:
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