Biotin-Ligasen sind Enzyme, die den Biotin-Transfer auf Biotin-abhängige Enzyme katalysieren, welche wiederum für essenzielle Stoffwechselwege wie die Gluconeogenese oder die Fettsäuresynthese von grundlegender Bedeutung sind. In Zeiten des Protein-Engineerings und Genome Editings können diese Enzyme jedoch auch auf andere, vielfältige Weise genutzt werden. In dieser Arbeit wurden Biotin-Ligasen für verschiedene Anwendungen eingesetzt, angefangen als Hilfsmittel zum grundlegenden Verständnis der Zellbiologie bis hin zu biopharmazeutischen Ansätzen. Zunächst wurde durch gerichtete Evolution ein neuartiges Enzym namens ultraID für Protein-Protein-Interaktionsstudien entwickelt. Dieses Unterfangen wurde durch Error-Prone PCR Mutagenese und Yeast Surface Display in Kombination mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung realisiert. Das identifizierte Enzym, das auf einer Biotin-Ligase aus Aquifex aeolicus basiert, wies einen massiv verbesserten katalytischen Umsatz auf, der auf eine einzige Mutation im aktiven Zentrum zurückgeführt werden konnte. Bislang ist ultraID eines der kleinsten und effizientesten Enzyme für die proximity-dependent biotin identification Methode. Als nächstes wurde die randomisierte Biotin-Ligasen Bibliothek auf ein modifiziertes Biotin Substrat durchmustert. Dabei wurde ein Propargyl-funktionalisiertes Biotin Derivat auf Enzymumsatz untersucht. Trotz der Anwendung verschiedener Präsentations- und Assay-Strategien konnte ein Propargyl-Biotin umsetzendes Enzym nicht identifiziert werden. Darüber hinaus wurden grundlegende Experimente zur Herstellung eines Antikörper-Wirkstoff-Konjugats durch Biotin-Ligasen durchgeführt. Eine aus Pyrococcus horikoshii stammende Biotin-Ligase wurde genutzt, um Propargyl-Biotin und Desthiobiotin-Azid an den therapeutischen Antikörper Trastuzumab zu konjugieren, der zuvor mit einer Biotin-Akzeptordomäne ausgestattet wurde. Es konnte erfolgreich gezeigt werden, dass eine chemoenzymatische Modifizierung durch Konjugation eines Fluorophors an den Antikörper möglich ist. Die Verwendung von Desthiobiotin-Azid als Substrat machte die Biotin-Ligase jedoch unspezifisch, sodass bei zukünftigen Ansätzen Optimierungen vorgenommen werden müssen. Parallel dazu wurde ein Antikörper-Wirkstoff-Konjugat mit einer anderen Konjugationsstrategie hergestellt. Die Liponsäure-Ligase A aus Escherichia coli wurde zum Anbringen eines Click-Chemie kompatiblen Moleküls an einen mit Enzym-Erkennungsmotiv modifizierten Trastuzumab verwendet. Das anschließende Funktionalisieren mit einem Monomethyl-Auristatin-E Toxin führte zur Herstellung eines Antikörper-Wirkstoff-Konjugats mit einer Wirksamkeit im picomolaren Bereich. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die angewandte Konjugationsstrategie keinen Einfluss auf die Affinität des Antikörpers hatte und die enzymatische Modifizierung innerhalb weniger Minuten abgeschlossen war. Zuletzt wurde die Identifizierung von internalisierenden single-chain variable fragments aus Phagen-Display-Bibliotheken von Patienten, welche an systemischem Lupus erythematodes leiden, durchgeführt. Dabei wurden verschiedene Anreicherungsstrategien untersucht, die eine Inkubation auf Säugetierzellen und eine Biotinylierung der Phagen nach erfolgreicher Zellpenetration beinhalteten. Letztendlich konnte kein internalisierender Binder gefunden werden, aber es wurden wichtige Erkenntnisse über die Anreicherung von zellpenetrierenden Bindern mittels Phagen-Display gewonnen.