Bodden, Malena (2023)
GD2-spezifische CAR-NK-Zellen für die adoptive Krebsimmuntherapie.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00023636
Dissertation, Erstveröffentlichung, Verlagsversion

Kurzbeschreibung (Abstract)

Das Disialogangliosid GD2 weist in gesundem Gewebe eine eingeschränkte Expression auf und findet sich überwiegend nur im zentralen Nervensystem, auf peripheren Nerven und mesenchymalen Stromazellen. Es ist jedoch in erhöhtem Maß in tumorösem Gewebe exprimiert und liegt primär auf Tumoren neuroektodermalen Ursprungs wie dem Neuroblastom oder dem Melanom und in unterschiedlichem Ausmaß auch auf Sarkomen oder Brustkrebs-Stammzellen vor. GD2 spielt eine wesentliche Rolle in der Kanzerogenese und seine Expression korreliert mit einer gesteigerten Tumorprogression und einer schlechteren Prognose. Der Behandlungserfolg zielgerichteter GD2-spezifischer Therapien mit monoklonalen Antikörpern oder Immunzytokinen ist jedoch begrenzt. Obwohl einige immuntherapeutische Ansätze bei Melanom- und Neuroblastompatienten zu einem verlängerten Überleben führten, waren dennoch etwa 50 % der behandelten Patienten von einem Rezidiv betroffen. Ebenso zeigten Antikörper-basierte Behandlungsansätze keinen Effekt bei bereits fortgeschrittenen Tumoren. Ziel dieser Arbeit war es daher, NK-Zell-basierte Therapieansätze als möglichen alternativen Behandlungsansatz für GD2-positive Tumoren zu prüfen. NK-Zellen sind Teil des angeborenen Immunsystems, welche in der Lage sind, gestresste und transformierte Zellen ohne vorherige Sensibilisierung zu lysieren. Neben primären NK-Zellen können in der adoptiven Immuntherapie auch immortalisierte Zelllinien wie NK-92 als off-the-shelf-Produkt eingesetzt werden. In klinischen Studien wurde die Sicherheit der Injektion bestrahlter NK-92-Zellen nachgewiesen. Zur Steigerung ihres therapeutischen Potenzials können diese mit einem chimären Antigenrezeptor (Chimeric antigen receptor, CAR), welcher ein spezifisches Tumorantigen erkennt, modifiziert werden. CARs bestehen aus einer von einem scFv (Single chain fragment variable)-Antikörperfragment abgeleiteten Bindedomäne, welche über eine flexible hinge-Region an eine Transmembrandomäne fusioniert ist, gefolgt von der intrazellulären Signaldomäne der CD3ζ-Kette. CARs der zweiten Generation enthalten eine zusätzliche ko-stimulatorische Domäne wie CD28. Um die Aktivität von NK-92 gegen GD2-exprimierende Tumorzellen zu erhöhen, wurden in dieser Arbeit NK-92-Zellen mit einem GD2-spezifischen CAR der zweiten Generation, welcher ein scFv-Fragment des Antikörpers hu14.18 enthält (CAR hu14.18.28.z), lentiviral transduziert. Darauf aufbauend wurde zudem ein Therapieansatz entwickelt, welcher auf CAR-NK-92-Zellen beruhte, die neben dem GD2-spezifischen CAR den IL-15-Superagonisten RD-IL15 ektopisch exprimierten. Hierfür wurden NK-92-Zellen mit einem bicistronischen lentiviralen Vektor kodierend für den GD2-spezifischen CAR und RD-IL15 transduziert (CAR hu14.18.28.z_RD-IL15). Durch die zusätzliche Expression des IL-15-Superagonisten sollte eine verbesserte Proliferation und antitumorale Aktivität sowohl der Produzentenzellen selbst als auch umgebender Immuneffektorzellen erreicht werden. Nach der lentiviralen Transduktion mit den CAR-Konstrukten wurde eine durchflusszytometrische Zellsortierung durchgeführt, um reine Zellpopulationen der CAR-exprimierenden NK-92-Zellen zu erhalten. Nach der Bestätigung der CAR-Expression erfolgte die funktionelle Charakterisierung in vitro. Hierbei wiesen sowohl NK-92/hu14.18.28.z- als auch NK-92/hu14.18.28.z_RD-IL15-Zellen eine vergleichbar hohe und selektive Zytotoxizität gegenüber murinen und humanen GD2-positiven Tumorzellen auf. Die erfolgreiche Expression und Sekretion von RD-IL15 durch NK-92/hu14.18.28.z_RD-IL15-Zellen wurde mittels durchflusszytometrischer Analysen und ELISA bestätigt. In Immunoblot-Analysen wurde in den Lysaten der Produzentenzellen phosphoryliertes STAT5 nachgewiesen, was die autokrine Aktivierung des IL-15-Rezeptorkomplexes durch RD-IL15 und somit die Funktionalität des IL-15-Superagonisten aufzeigte. Durch die ektopische Expression von RD-IL15 waren NK-92/hu14.18.28.z_RD-IL15-Zellen zudem in der Lage, ohne exogenes IL-2 zu proliferieren und ihr zytotoxisches Potenzial aufrecht zu erhalten. Ein möglicher negativer Effekt der dauerhaften autokrinen RD-IL15-Stimulierung auf den Aktivierungszustand der CAR-NK-92-Zellen konnte nach durchflusszytometrischer Analyse aktivierender und inhibitorischer Marker ausgeschlossen werden. Vielmehr weisen die erhaltenen Daten darauf hin, dass der IL-15-Superagonist einem anergischen Zustand der Produzentenzellen entgegenwirkt. Die mögliche parakrine Stimulierung primärer bystander Zellen durch NK-92/hu14.18.28.z_RD-IL15-Zellen wurde in Transwell-Experimenten untersucht. Hierbei zeigte sich, dass Zytokin-sekretierende CAR-NK-92-Zellen in der Lage waren, die natürliche Zytotoxizität ko-kultivierter primärer Lymphozyten gegenüber der MHC I-negativen Tumorzelllinie K562 zu steigern. Ebenso erhöhte sich in gemischten Lymphozytenreaktionen durch sekretiertes RD-IL15 die Proliferation primärer NK-Zellen und CD8-positiver T-Zellen. Als alternativer Ansatz zur Behandlung GD2-positiver Tumoren wurde in dieser Arbeit zudem ein GD2-spezifischer Miniantikörper (hu14.18-Fc) entwickelt. Dieser setzt sich aus dem scFv-Fragment des humanisierten, GD2-spezifischen Antikörpers hu14.18 und einer IgG1-Fc-Domäne zusammen. Nach Bestätigung der spezifischen Bindung von hu14.18-Fc an GD2-exprimierende Tumorzellen wurde die immunstimulatorische Wirkung des rekombinanten Moleküls auf primäre NK-Zellen in einem Zytotoxizitätsassay untersucht. Hierbei wiesen die Effektorzellen nach Zugabe des Miniantikörpers eine signifikant erhöhte Antitumoraktivität gegenüber der GD2-positiven murinen Lymphomzelllinie EL4 auf. In abschließenden in vivo Untersuchungen wurde die Antitumoraktivität der NK-92/hu14.18.28.z- und NK-92/hu14.18.28.z_RD-IL15-Zellen sowie ein möglicher zusätzlicher Effekt des IL-15-Superagonisten in einem Neuroblastom-Xenograftmodell und einem Lymphom-Allograftmodell überprüft. Zur Etablierung des Xenograftmodells wurden UKF-NB3-Zellen intravenös in immundefiziente NSG-Mäuse appliziert. Die systemische Behandlung mit parentalen NK-92-Zellen und RD-IL15-sekretierenden CAR-NK-92-Zellen führte zu einer Verlangsamung des Tumorwachstums in einem Großteil der Mäuse. Jedoch zeigte die Gruppe, welche NK-92/hu14.18.28.z_RD-IL15-Zellen erhielt, keinen Überlebensvorteil gegenüber den Kontrollgruppen. Für die Etablierung des Allograftmodells erfolgte eine systemische Injektion der murinen Lymphomzelllinie EL4 in NSG-Mäuse. Hierbei führten weder eine intravenöse Injektion parentaler NK-92-Zellen noch CAR-NK-92-Zellen ohne oder mit ektopischer RD-IL15-Expression zu einer verminderten Tumorprogression oder einem Überlebensvorteil. Das Fehlen eines zusätzlichen Effekts der CAR-NK-92-Zellen im Vergleich zu parentalen NK-92-Zellen im UKF-NB3-Modell könnte durch die bereits sehr ausgeprägte Sensitivität der Tumorzellen gegen die natürliche Zytotoxizität der NK-Zellen erklärt werden. Im Fall des EL4- Modells verhinderte das aggressive Wachstum der Tumorzellen sehr wahrscheinlich einen messbaren Effekt der modifizierten NK-92-Zellen und des sekretierten RD-IL15. Die hier erarbeiteten, vielversprechenden in vitro Daten lassen dennoch eine Weiterentwicklung dieses Ansatzes sinnvoll erscheinen. In nachfolgenden Studien sollte dabei der Fokus auf die Etablierung verbesserter in vivo Modelle gelegt werden, die es dann erlauben könnten, die möglichen Effekte der CAR- und RD-IL15-Expression herauszuarbeiten. Zudem könnte untersucht werden, ob eine mögliche Steigerung der autokrinen Wirkung von RD-IL15 zu einem verbesserten therapeutischen Effekt der Zytokin-sekretierenden CAR-NK-92-Zellen führen kann.

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