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Interaktionsstudien der GvpACNO Proteine und Implikationen für die Gasvesikelbildung von Halobacterium salinarum

Jost, Alisa (2022)
Interaktionsstudien der GvpACNO Proteine und Implikationen für die Gasvesikelbildung von Halobacterium salinarum.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00021605
Dissertation, Erstveröffentlichung, Verlagsversion

Kurzbeschreibung (Abstract)

Die Gasvesikelbildung in Hbt. salinarum PHH1 wird durch die Expression der p-vac-Region gesteuert. Die p-vac Region besteht aus 14 gvp-Genen, die in zwei entgegengesetzten Gengruppen angeordnet sind, gvpACNO und gvpDEFGHIJKLM. Die Gene gvpFGHIJKLM exprimieren die gleichnamigen Gvp-Proteine, die zu Beginn der Gasvesikelbildung gebildet werden und wahrscheinlich einen Initialkomplex bilden, an dem die Gasvesikelbildung startet. GvpD und GvpE sind regulatorische Proteine, die als Transkriptionsaktivator (GvpE) bzw. -repressor (GvpD) dienen. Aufgebaut wird das Gasvesikel hauptsächlich aus GvpA, dem Hauptstrukturprotein der Gasvesikelhülle, und GvpC, das diese Hülle von außen stabilisiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden erstmals die Interaktionen der ACNO-Proteine untersucht. Dazu wurden zwei verschiedene Untersuchungsmethoden angewandt; die split-GFP-Methode und ein Pulldown-Assay mit der Cellulose-Bindedomäne. Dabei standen vor allem die beiden Strukturproteine GvpA und GvpC im Vordergrund, welche auch durch Fragmentierungen näher untersucht wurden. Dabei zeigte sich, dass besonders der N-terminale Teil von GvpA und der C-terminale Teil von GvpC viele Bindungen mit anderen Gasvesikelproteinen eingehen können. Insgesamt ist die Fragmentierung von Proteinen eine gute Möglichkeit, um die Interaktionsstellen in Proteinen näher zu definieren und einzugrenzen. Zusätzlich wurden diese durch Mutationsstudien untersucht, durch die sowohl in GvpA als auch in GvpJ wichtige Aminosäuren bzw. Motive gefunden wurden, die an der Interaktion von GvpA/GvpF bzw. GvpJ/GvpL beteiligt sind oder diese vermitteln. Dabei nehmen die sehr ähnlichen Proteine GvpA, GvpJ und GvpM im Interaktionsnetzwerk eigenständige Rollen ein. Sie sind nicht gegeneinander austauschbar, sondern interagieren mit verschiedenen Proteinen und über unterschiedliche Interaktionsstellen. Durch die untersuchten Interaktionen zwischen den akzessorischen Proteinen und den ACNO-Proteinen konnte ein vollständiges Interaktionsnetzwerk etabliert werden, an dem alle Gvp-Proteine (außer GvpD und GvpE) beteiligt sind. GvpL weist dabei die meisten und stärksten Interaktionen zu anderen Proteinen auf und nimmt so eine zentrale Rolle in der Gasvesikelbildung und der frühen Komplexbildung zu Beginn der Gasvesikelsynthese ein. Dieser Komplex oder Teilkomplexe aus mehreren akzessorischen Proteinen konnten erstmals über ein bait-Protein isoliert werden. Dazu wurde CBDA verwendet, das nicht in der Lage ist, alle akzessorischen Proteine in Einzelinteraktionen zu binden. Wenn jedoch GvpF bis GvpM mit CBDA co-synthetisiert werden, können alle Proteine durch Western-Analysen detektiert werden. Dazu müssen die akzessorischen Proteine untereinander Interaktionen eingehen, die darauf hindeuten, dass diese einen oder mehrere Komplexe zu Beginn der Gasvesikelsynthese bilden. Der Einbau von GvpA geschieht höchstwahrscheinlich mit GvpF als Bindungspartner, wobei die alpha-Helix 1 von GvpA eine entscheidende Rolle spielt. Um die Dimerisierung von GvpA und damit den Aufbau des Gasvesikels näher zu untersuchen, wurde zusätzlich das bereits etablierte split-GFP-System durch zwei Vektoren erweitert, die eine Interaktionsstudie zweier Proteine in Anwesenheit von weiteren Proteinen ermöglicht. Hier konnte gezeigt werden, dass die GvpA-Dimerisierung erst durch GvpC, GvpN und GvpO ermöglicht wird. GvpN kommt dabei wahrscheinlich eine entscheidende Aufgabe zu, da ein Fehlen von GvpN zu sehr kleinen Gasvesikeln führt, die nicht vergrößert werden können. Besonders das NTP-bindende Motiv (p-loop-Motiv) in GvpN erwies sich als wichtig für die Ausbildung von Gasvesikeln.

Typ des Eintrags: Dissertation
Erschienen: 2022
Autor(en): Jost, Alisa
Art des Eintrags: Erstveröffentlichung
Titel: Interaktionsstudien der GvpACNO Proteine und Implikationen für die Gasvesikelbildung von Halobacterium salinarum
Sprache: Deutsch
Referenten: Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas ; Kletzin, PD Dr. Arnulf
Publikationsjahr: 2022
Ort: Darmstadt
Kollation: 129 Seiten
Datum der mündlichen Prüfung: 16 August 2022
DOI: 10.26083/tuprints-00021605
URL / URN: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/21605
Kurzbeschreibung (Abstract):

Die Gasvesikelbildung in Hbt. salinarum PHH1 wird durch die Expression der p-vac-Region gesteuert. Die p-vac Region besteht aus 14 gvp-Genen, die in zwei entgegengesetzten Gengruppen angeordnet sind, gvpACNO und gvpDEFGHIJKLM. Die Gene gvpFGHIJKLM exprimieren die gleichnamigen Gvp-Proteine, die zu Beginn der Gasvesikelbildung gebildet werden und wahrscheinlich einen Initialkomplex bilden, an dem die Gasvesikelbildung startet. GvpD und GvpE sind regulatorische Proteine, die als Transkriptionsaktivator (GvpE) bzw. -repressor (GvpD) dienen. Aufgebaut wird das Gasvesikel hauptsächlich aus GvpA, dem Hauptstrukturprotein der Gasvesikelhülle, und GvpC, das diese Hülle von außen stabilisiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden erstmals die Interaktionen der ACNO-Proteine untersucht. Dazu wurden zwei verschiedene Untersuchungsmethoden angewandt; die split-GFP-Methode und ein Pulldown-Assay mit der Cellulose-Bindedomäne. Dabei standen vor allem die beiden Strukturproteine GvpA und GvpC im Vordergrund, welche auch durch Fragmentierungen näher untersucht wurden. Dabei zeigte sich, dass besonders der N-terminale Teil von GvpA und der C-terminale Teil von GvpC viele Bindungen mit anderen Gasvesikelproteinen eingehen können. Insgesamt ist die Fragmentierung von Proteinen eine gute Möglichkeit, um die Interaktionsstellen in Proteinen näher zu definieren und einzugrenzen. Zusätzlich wurden diese durch Mutationsstudien untersucht, durch die sowohl in GvpA als auch in GvpJ wichtige Aminosäuren bzw. Motive gefunden wurden, die an der Interaktion von GvpA/GvpF bzw. GvpJ/GvpL beteiligt sind oder diese vermitteln. Dabei nehmen die sehr ähnlichen Proteine GvpA, GvpJ und GvpM im Interaktionsnetzwerk eigenständige Rollen ein. Sie sind nicht gegeneinander austauschbar, sondern interagieren mit verschiedenen Proteinen und über unterschiedliche Interaktionsstellen. Durch die untersuchten Interaktionen zwischen den akzessorischen Proteinen und den ACNO-Proteinen konnte ein vollständiges Interaktionsnetzwerk etabliert werden, an dem alle Gvp-Proteine (außer GvpD und GvpE) beteiligt sind. GvpL weist dabei die meisten und stärksten Interaktionen zu anderen Proteinen auf und nimmt so eine zentrale Rolle in der Gasvesikelbildung und der frühen Komplexbildung zu Beginn der Gasvesikelsynthese ein. Dieser Komplex oder Teilkomplexe aus mehreren akzessorischen Proteinen konnten erstmals über ein bait-Protein isoliert werden. Dazu wurde CBDA verwendet, das nicht in der Lage ist, alle akzessorischen Proteine in Einzelinteraktionen zu binden. Wenn jedoch GvpF bis GvpM mit CBDA co-synthetisiert werden, können alle Proteine durch Western-Analysen detektiert werden. Dazu müssen die akzessorischen Proteine untereinander Interaktionen eingehen, die darauf hindeuten, dass diese einen oder mehrere Komplexe zu Beginn der Gasvesikelsynthese bilden. Der Einbau von GvpA geschieht höchstwahrscheinlich mit GvpF als Bindungspartner, wobei die alpha-Helix 1 von GvpA eine entscheidende Rolle spielt. Um die Dimerisierung von GvpA und damit den Aufbau des Gasvesikels näher zu untersuchen, wurde zusätzlich das bereits etablierte split-GFP-System durch zwei Vektoren erweitert, die eine Interaktionsstudie zweier Proteine in Anwesenheit von weiteren Proteinen ermöglicht. Hier konnte gezeigt werden, dass die GvpA-Dimerisierung erst durch GvpC, GvpN und GvpO ermöglicht wird. GvpN kommt dabei wahrscheinlich eine entscheidende Aufgabe zu, da ein Fehlen von GvpN zu sehr kleinen Gasvesikeln führt, die nicht vergrößert werden können. Besonders das NTP-bindende Motiv (p-loop-Motiv) in GvpN erwies sich als wichtig für die Ausbildung von Gasvesikeln.

Alternatives oder übersetztes Abstract:
Alternatives AbstractSprache

Gas vesicle formation in Hbt. salinarum PHH1 is controlled by expression of the p-vac region. The p-vac region consists of 14 gvp genes arranged in two opposing gene groups, gvpACNO and gvpDEFGHIJKLM. The gvpFGHIJKLM genes express the Gvp proteins of the same name, which are formed at the beginning of gas vesicle formation and probably form an initial complex where gas vesicle formation starts. GvpD and GvpE are regulatory proteins that serve as transcriptional activator (GvpE) and repressor (GvpD), respectively. The gas vesicle is mainly composed of GvpA, the main structural protein of the gas vesicle envelope, and GvpC, which stabilizes this envelope from the outside. In this work, the interactions of the ACNO proteins were investigated for the first time. Two different assay methods were used for this purpose; the split-GFP method and a pull-down assay with the cellulose binding domain. The main focus was on the two structural proteins GvpA and GvpC, which were also investigated in more detail by fragmentation. This showed that especially the N-terminal part of GvpA and the C-terminal part of GvpC can form many bonds with other gas vesicle proteins. Overall, protein fragmentation is a good way to further define and narrow down the interaction sites in proteins. In addition, these have been investigated by mutation studies, by which important amino acids or motifs involved in or mediating the interaction of GvpA/GvpF and GvpJ/GvpL, respectively, have been found in both GvpA and GvpJ. Here, the very similar proteins GvpA, GvpJ, and GvpM assume independent roles in the interaction network. They are not interchangeable, but interact with different proteins and through different interaction sites. The interactions studied between the accessory proteins and the ACNO proteins established a complete interaction network involving all Gvp proteins (except GvpD and GvpE). GvpL exhibits the most and strongest interactions with other proteins and thus occupies a central role in gas vesicle formation and early complex formation at the onset of gas vesicle synthesis. This complex or partial complexes of several accessory proteins could be isolated for the first time via a bait protein. CBDA, which is not able to bind all accessory proteins in single interactions, was used for this purpose. However, when GvpF to GvpM are co-synthesized with CBDA, all proteins can be detected by Western analyses. For this to occur, the accessory proteins must form interactions with each other, indicating that they form one or more complexes at the onset of gas vesicle synthesis. The incorporation of GvpA most likely occurs with GvpF as a binding partner, with the alpha-helix 1 of GvpA playing a crucial role. In order to investigate the dimerization of GvpA and thus the assembly of the gas vesicle in more detail, the already established split-GFP system was additionally extended by two vectors, allowing an interaction study of two proteins in the presence of additional proteins. Here it could be shown that GvpA dimerization is first enabled by GvpC, GvpN and GvpO. GvpN probably has a crucial role in this process, since absence of GvpN leads to very small gas vesicles that cannot be enlarged. In particular, the NTP-binding motif (p-loop motif) in GvpN proved to be important for the formation of gas vesicles.

Englisch
Status: Verlagsversion
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-216050
Sachgruppe der Dewey Dezimalklassifikatin (DDC): 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Fachbereich(e)/-gebiet(e): 10 Fachbereich Biologie
10 Fachbereich Biologie > Microbiology and Archaea
Hinterlegungsdatum: 26 Sep 2022 09:41
Letzte Änderung: 27 Sep 2022 05:40
PPN:
Referenten: Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas ; Kletzin, PD Dr. Arnulf
Datum der mündlichen Prüfung / Verteidigung / mdl. Prüfung: 16 August 2022
Export:
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