Jost, Alisa (2022)
Interaktionsstudien der GvpACNO Proteine und Implikationen für die Gasvesikelbildung von Halobacterium salinarum.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00021605
Dissertation, Erstveröffentlichung, Verlagsversion

Kurzbeschreibung (Abstract)

Die Gasvesikelbildung in Hbt. salinarum PHH1 wird durch die Expression der p-vac-Region gesteuert. Die p-vac Region besteht aus 14 gvp-Genen, die in zwei entgegengesetzten Gengruppen angeordnet sind, gvpACNO und gvpDEFGHIJKLM. Die Gene gvpFGHIJKLM exprimieren die gleichnamigen Gvp-Proteine, die zu Beginn der Gasvesikelbildung gebildet werden und wahrscheinlich einen Initialkomplex bilden, an dem die Gasvesikelbildung startet. GvpD und GvpE sind regulatorische Proteine, die als Transkriptionsaktivator (GvpE) bzw. -repressor (GvpD) dienen. Aufgebaut wird das Gasvesikel hauptsächlich aus GvpA, dem Hauptstrukturprotein der Gasvesikelhülle, und GvpC, das diese Hülle von außen stabilisiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden erstmals die Interaktionen der ACNO-Proteine untersucht. Dazu wurden zwei verschiedene Untersuchungsmethoden angewandt; die split-GFP-Methode und ein Pulldown-Assay mit der Cellulose-Bindedomäne. Dabei standen vor allem die beiden Strukturproteine GvpA und GvpC im Vordergrund, welche auch durch Fragmentierungen näher untersucht wurden. Dabei zeigte sich, dass besonders der N-terminale Teil von GvpA und der C-terminale Teil von GvpC viele Bindungen mit anderen Gasvesikelproteinen eingehen können. Insgesamt ist die Fragmentierung von Proteinen eine gute Möglichkeit, um die Interaktionsstellen in Proteinen näher zu definieren und einzugrenzen. Zusätzlich wurden diese durch Mutationsstudien untersucht, durch die sowohl in GvpA als auch in GvpJ wichtige Aminosäuren bzw. Motive gefunden wurden, die an der Interaktion von GvpA/GvpF bzw. GvpJ/GvpL beteiligt sind oder diese vermitteln. Dabei nehmen die sehr ähnlichen Proteine GvpA, GvpJ und GvpM im Interaktionsnetzwerk eigenständige Rollen ein. Sie sind nicht gegeneinander austauschbar, sondern interagieren mit verschiedenen Proteinen und über unterschiedliche Interaktionsstellen. Durch die untersuchten Interaktionen zwischen den akzessorischen Proteinen und den ACNO-Proteinen konnte ein vollständiges Interaktionsnetzwerk etabliert werden, an dem alle Gvp-Proteine (außer GvpD und GvpE) beteiligt sind. GvpL weist dabei die meisten und stärksten Interaktionen zu anderen Proteinen auf und nimmt so eine zentrale Rolle in der Gasvesikelbildung und der frühen Komplexbildung zu Beginn der Gasvesikelsynthese ein. Dieser Komplex oder Teilkomplexe aus mehreren akzessorischen Proteinen konnten erstmals über ein bait-Protein isoliert werden. Dazu wurde CBDA verwendet, das nicht in der Lage ist, alle akzessorischen Proteine in Einzelinteraktionen zu binden. Wenn jedoch GvpF bis GvpM mit CBDA co-synthetisiert werden, können alle Proteine durch Western-Analysen detektiert werden. Dazu müssen die akzessorischen Proteine untereinander Interaktionen eingehen, die darauf hindeuten, dass diese einen oder mehrere Komplexe zu Beginn der Gasvesikelsynthese bilden. Der Einbau von GvpA geschieht höchstwahrscheinlich mit GvpF als Bindungspartner, wobei die alpha-Helix 1 von GvpA eine entscheidende Rolle spielt. Um die Dimerisierung von GvpA und damit den Aufbau des Gasvesikels näher zu untersuchen, wurde zusätzlich das bereits etablierte split-GFP-System durch zwei Vektoren erweitert, die eine Interaktionsstudie zweier Proteine in Anwesenheit von weiteren Proteinen ermöglicht. Hier konnte gezeigt werden, dass die GvpA-Dimerisierung erst durch GvpC, GvpN und GvpO ermöglicht wird. GvpN kommt dabei wahrscheinlich eine entscheidende Aufgabe zu, da ein Fehlen von GvpN zu sehr kleinen Gasvesikeln führt, die nicht vergrößert werden können. Besonders das NTP-bindende Motiv (p-loop-Motiv) in GvpN erwies sich als wichtig für die Ausbildung von Gasvesikeln.

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