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T cell-targeted gene delivery: Rapid CAR T cell generation without full activation

Kapitza, Laura (2022)
T cell-targeted gene delivery: Rapid CAR T cell generation without full activation.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00021648
Dissertation, Erstveröffentlichung, Verlagsversion

Kurzbeschreibung (Abstract)

Lentiviral vectors (LVs) are potent tools to genetically modify hematopoietic stem cells (HSCs), T cells or B cells. Genetic engineering of T cells to express a chimeric antigen receptor (CAR) was termed the breakthrough therapy of the year 2013 by the journal Science and ever since numerous approaches using CAR T cells for different targets are being investigated. CAR T cell therapy celebrated its greatest successes so far in 2018, when two CAR T cell products received marketing authorization by the food and drug administration (FDA) and the European commission (EC). Despite its promising results, CAR T cell therapy still needs to overcome various hurdles, including a complicated and time-consuming manufacturing process. Additionally, a protocol which generates high amounts of less differentiated T cells, that were shown to be beneficial in regard of CAR T cell persistence, would be of advantage to avoid cumbersome selection of specific CAR T cell subsets. In this thesis, a receptor-targeted LV specific for CD62L was established to ease and shorten the CAR T cell manufacturing process and obtain higher amounts of preferred CAR T cell phenotypes than are derived after transduction with a vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) pseudotyped LV. These beneficial T cell subsets are expressing CD62L and this circumstance was crucial for producing a CD62L receptor-targeted LV (62L-LV). First steps for establishment of 62L-LV included choosing the appropriate LV receptor-targeting proteins. Therefore, surface expression of a CD62L specific single chain variable fragment (scFv) fused to different envelope proteins was analyzed. Afterwards, vector particles were generated that encoded the green fluorescent protein (gfp). As a first proof-of-concept these vector particles were tested for their ability to selectivity deliver the transgene to CD62L+ cell lines. Besides, an αCD19-CAR was analyzed that later was planned to be packaged into 62L-LV. As a start to characterize this CAR, it was packaged into the already established receptor-targeted LVs: CD4-LV and CD8-LV. The CAR gene delivery potency of respective LVs to human T cells was analyzed in presence and absence of a transduction enhancer. The arising transduced T cells were proven for their ability to kill target cells. Moreover it was uncovered that the CAR and the reporter protein can be transferred as protein from LV packaging cells to T cells. Notably, this was discovered only because of the usage of T cell-targeted LVs. After initial testing of CD62L-LV-gfp and the αCD19-CAR both were combined and the resulting vector was analyzed for correct vector particle assembly via Western blot. Robustness of LV production was analyzed by quantifying particle numbers and gene delivery approaches. In addition, specificity of gene transfer was proven on cell lines and primary cells. Furthermore, the influence of shed CD62L on vector particle binding was investigated. Additionally, transduction efficiency of T cells and phenotypes of transduced T cells were evaluated. Transduction rate using a transduction enhancer was reaching levels similar to those obtained with VSV-LV. Interestingly, T cells transduced with 62-LV were less differentiated in vitro even after full activation. Even more so, the ability to deliver transgenes to minimally activated T cells was investigated in vitro and in vivo. While minimally activated T cells were functional in vitro after both transduction with VSV-LV and 62L-LV, an initial in vivo study suggested that receptor-targeted LV outperformed VSV-LV in an antitumoral mouse model. Fully and minimally activated transduced T cells were injected into mice as early as 24 hours after incubation with vector and were challenged with antigen by application of CD19 positive tumor cells three days later. Tumor growth was followed regularly by in vivo bioluminescence imaging. Indeed, the full activated CAR T cells were antitumorally active, however, 62L-LV incubated T cells outperformed T cells that were incubated with VSV-LV in the setting with minimally activated T cells. Thus, only 62L-LV incubated minimally activated T cells were antitumorally functional in the antitumor mouse model. Distribution of transgene expressing T cells in various organs was inspected, as well as their phenotypes and exhaustion profiles. In mice that had less tumor load compared to a control group, CAR T cells populated various organs. Interestingly, CAR T cells from mice receiving minimally activated T cells incubated with 62L-LV had a higher amount of less differentiated cells in comparison to fully activated T cells. In conclusion, a novel receptor-targeted LV was successfully generated which is specific for CD62L. Usage of 62L-LV allowed generation of potent CAR T cells within less than two days and did not require full activating stimuli. 62L-LV can be a potent tool in the CAR T cell therapy field to generate CAR T cells with beneficial phenotypes very rapidly.

Typ des Eintrags: Dissertation
Erschienen: 2022
Autor(en): Kapitza, Laura
Art des Eintrags: Erstveröffentlichung
Titel: T cell-targeted gene delivery: Rapid CAR T cell generation without full activation
Sprache: Englisch
Referenten: Nuber, Prof. Dr. Ulrike ; Buchholz, Prof. Dr. Christian J.
Publikationsjahr: 2022
Ort: Darmstadt
Kollation: 108 Seiten
Datum der mündlichen Prüfung: 2 August 2021
DOI: 10.26083/tuprints-00021648
URL / URN: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/21648
Kurzbeschreibung (Abstract):

Lentiviral vectors (LVs) are potent tools to genetically modify hematopoietic stem cells (HSCs), T cells or B cells. Genetic engineering of T cells to express a chimeric antigen receptor (CAR) was termed the breakthrough therapy of the year 2013 by the journal Science and ever since numerous approaches using CAR T cells for different targets are being investigated. CAR T cell therapy celebrated its greatest successes so far in 2018, when two CAR T cell products received marketing authorization by the food and drug administration (FDA) and the European commission (EC). Despite its promising results, CAR T cell therapy still needs to overcome various hurdles, including a complicated and time-consuming manufacturing process. Additionally, a protocol which generates high amounts of less differentiated T cells, that were shown to be beneficial in regard of CAR T cell persistence, would be of advantage to avoid cumbersome selection of specific CAR T cell subsets. In this thesis, a receptor-targeted LV specific for CD62L was established to ease and shorten the CAR T cell manufacturing process and obtain higher amounts of preferred CAR T cell phenotypes than are derived after transduction with a vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) pseudotyped LV. These beneficial T cell subsets are expressing CD62L and this circumstance was crucial for producing a CD62L receptor-targeted LV (62L-LV). First steps for establishment of 62L-LV included choosing the appropriate LV receptor-targeting proteins. Therefore, surface expression of a CD62L specific single chain variable fragment (scFv) fused to different envelope proteins was analyzed. Afterwards, vector particles were generated that encoded the green fluorescent protein (gfp). As a first proof-of-concept these vector particles were tested for their ability to selectivity deliver the transgene to CD62L+ cell lines. Besides, an αCD19-CAR was analyzed that later was planned to be packaged into 62L-LV. As a start to characterize this CAR, it was packaged into the already established receptor-targeted LVs: CD4-LV and CD8-LV. The CAR gene delivery potency of respective LVs to human T cells was analyzed in presence and absence of a transduction enhancer. The arising transduced T cells were proven for their ability to kill target cells. Moreover it was uncovered that the CAR and the reporter protein can be transferred as protein from LV packaging cells to T cells. Notably, this was discovered only because of the usage of T cell-targeted LVs. After initial testing of CD62L-LV-gfp and the αCD19-CAR both were combined and the resulting vector was analyzed for correct vector particle assembly via Western blot. Robustness of LV production was analyzed by quantifying particle numbers and gene delivery approaches. In addition, specificity of gene transfer was proven on cell lines and primary cells. Furthermore, the influence of shed CD62L on vector particle binding was investigated. Additionally, transduction efficiency of T cells and phenotypes of transduced T cells were evaluated. Transduction rate using a transduction enhancer was reaching levels similar to those obtained with VSV-LV. Interestingly, T cells transduced with 62-LV were less differentiated in vitro even after full activation. Even more so, the ability to deliver transgenes to minimally activated T cells was investigated in vitro and in vivo. While minimally activated T cells were functional in vitro after both transduction with VSV-LV and 62L-LV, an initial in vivo study suggested that receptor-targeted LV outperformed VSV-LV in an antitumoral mouse model. Fully and minimally activated transduced T cells were injected into mice as early as 24 hours after incubation with vector and were challenged with antigen by application of CD19 positive tumor cells three days later. Tumor growth was followed regularly by in vivo bioluminescence imaging. Indeed, the full activated CAR T cells were antitumorally active, however, 62L-LV incubated T cells outperformed T cells that were incubated with VSV-LV in the setting with minimally activated T cells. Thus, only 62L-LV incubated minimally activated T cells were antitumorally functional in the antitumor mouse model. Distribution of transgene expressing T cells in various organs was inspected, as well as their phenotypes and exhaustion profiles. In mice that had less tumor load compared to a control group, CAR T cells populated various organs. Interestingly, CAR T cells from mice receiving minimally activated T cells incubated with 62L-LV had a higher amount of less differentiated cells in comparison to fully activated T cells. In conclusion, a novel receptor-targeted LV was successfully generated which is specific for CD62L. Usage of 62L-LV allowed generation of potent CAR T cells within less than two days and did not require full activating stimuli. 62L-LV can be a potent tool in the CAR T cell therapy field to generate CAR T cells with beneficial phenotypes very rapidly.

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Zur genetischen Manipulation von hämatopoetischen Stammzellen, T- und B-Zellen werden heutzutage meist lentivirale Vektoren (LVs) eingesetzt. T-Zellen können beispielsweise verändert werden, sodass sie einen chimären Antigenrezeptor (chimeric antigen receptor, CAR) exprimieren. Dieser verleiht den entstehenden CAR-T-Zellen das Vermögen, Tumorzellen, welche das CAR-Antigen exprimieren, spezifisch zu erkennen und zu eliminieren. Diese Therapie wurde im Jahr 2013 vom Science Magazin als herausragende Strategie breakthrough of the year) bezeichnet und fand seither in zahlreichen wissenschaftlichen Untersuchungen Anwendung. Den Höhepunkt des bisherigen Erfolgs erreichte die CAR-T-Zelltherapie im Jahr 2018, als zwei CAR-T-Zellprodukte von der amerikanischen Behörde für Lebens- und Arzneimittel (food and drug administration, FDA) und der europäischen Kommission zugelassen wurden. Obwohl bereits vielversprechende Erfolge mit CAR-T-Zellen erzielt wurden, gibt es einige Einschränkungen, die es noch zu überwinden gilt. Zunächst ist die Produktion von CAR-T-Zellen aufwändig und zeitintensiv. Zudem ist es bisher unbekannt, welche Subtypen von CAR-T-Zellen die größte Effektivität hervorrufen. Studien zeigten, dass die Zusammensetzung der CAR-T Zellsubtypen im finalen Produkt die Effizienz der modifizierten Zellen im Kampf gegen die Tumorzellen beeinflusst. Wenig differenzierte CAR-T-Zellen erzielen bessere Erfolge als weit oder gar terminal differenzierte CAR-T-Zellen. Derzeit gibt es kein einheitliches Protokoll zur Generierung solcher wenig differenzierten CAR-T-Zellen. Es wäre von Vorteil ein Protokoll zu etablieren, das einen großen Anteil an wenig differenzierten CAR-T-Zellen im finalen Produkt erlaubt. In dieser Dissertation wurde ein Rezeptor-targetierter LV etabliert, der sowohl die Produktionszeit verkürzt, als auch einen höheren Anteil der präferierten CAR-T-Zellen generiert, als ein herkömmlicher LV, der mit dem Glycoprotein G des Vesikular Stomatitisvirus (VSV) pseudotypisiert wurde. Der neue LV ist spezifisch für den CD62L Rezeptor, welcher von wenig differenzierten T-Zellen exprimiert wird. Zur Etablierung des neuen LVs wurden zunächst geeignete Rezeptor-targetierten Glykoproteine getestet. Hierfür wurde die Oberflächenexpression eines CD62L spezifischen Einzelkörperkettenfragments (single chain variable fragment, scFv) fusioniert mit entweder dem Masernvirus (MV) Glykoprotein H, oder dem Nipahvirus (NiV) Glykoprotein G, untersucht. Im Folgenden wurden CD62L spezifische Vektoren hergestellt, welche für das grün fluoreszierende Protein (gfp) kodieren und deren Selektivität auf Zelllinien überprüft. Zeitgleich wurde ein CD19-spezifischer CAR auf Funktionalität geprüft. Um Variablen möglichst gering zu halten, wurde das Transgen zunächst in bereits bekannten Rezeptor-targetierten CD4-LVs und CD8-LVs verpackt und diese Vektoren wurden genutzt, um T-Zellen zu transduzieren. In Experimenten, in welchen ein Transduktionsverstärker zum Einsatz kam, wurde deutlich, dass nicht nur die viralen Glykoproteine, sondern auch die vom Transgen kodierten Proteine in die Vektoroberfläche eingebaut wurden. Diese Entdeckung wurde möglich, weil T-zellspezifische LVs eingesetzt wurden. Des Weiteren konnte die Funktionalität der CD19-spezifischen CAR-T Zellen bestätigt werden. Nachfolgend wurde der CD62L-spezifische LV hergestellt, diesmal kodierend für den αCD19-CAR (kurz 62L-LV). Der vollständige Zusammenbau des LVs wurde durch Western Blotting bestätigt. Ferner belegte die Analyse mehrerer LV-Produktionen, dass der Vektor erfolgreich produziert werden konnte und CD62L-positive Zelllinien, sowie primäre T-Zellen selektiv transduziert wurden. Interessanterweise beeinflusste lösliches CD62L, welches während der Aktivierung von T-Zellen im Zellkulturüberstand vorliegt, die Transduktionseffizienz nicht. Tatsächlich konnte in vitro gezeigt werden, dass die Transduktion mit 62L-LV einen höheren Anteil an wenig differenzierten CAR-T-Zellen hervorbringt, als die Transduktion mit VSV-LV. Um die Funktionalität von CAR-T-Zellen nach einer minimalen Inkubationszeit mit 62L-LV oder VSV-LV von weniger als 24 Stunden zu überprüfen, wurden T-Zellen entweder voll oder nur minimal aktiviert nach einer Inkubation von weniger als einem Tag in Mäuse injiziert. Drei Tage später wurden die CAR T Zellen in vivo mit Antigen-positiven Tumorzellen angeregt. Durch die Luziferaseaktivität der Tumorzellen konnte das Tumorwachstum in den Mäusen mittels eines Bildgebungssystems (in vivo imaging) verfolgt werden. Interessanterweise wurde das Tumorwachstum in allen Mäusen, welche voll aktivierte CAR-T-Zellen erhielten, verhindert, während die minimal stimulierten CAR-T-Zellen nur antitumorale Aktivität aufwiesen, wenn sie mit 62L-LV aber nicht VSV-LV inkubiert worden waren. In Mäusen, bei denen eine antitumorale Reaktion beobachtet wurde, konnte die Verteilung von CAR-T-Zellen in mehreren Organen nachgewiesen werden. Die minimal stimulierten, 62L-LV inkubierten CAR-T-Zellen wiesen nach Explantation aus den Mäusen signifikant höhere Anteile an wenig differenzierten CAR-T-Zellen auf, als solche die vor Implantation voll aktiviert worden waren. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass der neue Rezeptor-targetierte 62L-LV erfolgreich reproduzierbar hergestellt wurde. Ferner konnte seine Spezifität bewiesen werden und sein großes Potenzial ein CAR-Transgen in primäre T-Zellen zu integrieren. Da er in der Lage war, nach weniger als 24 Stunden Inkubation mit nur minimal aktivierten T-Zellen, funktionale CAR-T Zellen zu generieren, wird diesem Vektor ein äußerst vielverprechendes Potenzial zugesprochen. Durch seine Fähigkeiten CAR-T-Zellen mit einem präferierten Phänotyp in sehr kurzer Zeit herzustellen könnte 62L-LV zukünftig in der CAR-T-Zelltherapie eine große Rolle spielen.

Deutsch
Status: Verlagsversion
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-216485
Sachgruppe der Dewey Dezimalklassifikatin (DDC): 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Fachbereich(e)/-gebiet(e): 10 Fachbereich Biologie
10 Fachbereich Biologie > Stammzell- und Entwicklungsbiologie
Hinterlegungsdatum: 26 Jul 2022 11:39
Letzte Änderung: 14 Dez 2022 17:54
PPN: 497916312
Referenten: Nuber, Prof. Dr. Ulrike ; Buchholz, Prof. Dr. Christian J.
Datum der mündlichen Prüfung / Verteidigung / mdl. Prüfung: 2 August 2021
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