In den letzten zehn Jahren wurde die Phasentrennung als Mechanismus für die Bildung verschiedener subzellulärer Kompartimente vorgeschlagen, z. B. für die Kompartimentierung des Chromatins in eukaryotischen Zellkernen. Die Voraussetzungen für die Chromatinkompartimentierung wurden jedoch nicht gut charakterisiert und es wurden mehrere sich überschneidende Faktoren diskutiert. Ziel dieser Studie war es, einen Einblick in die Funktion und die zugrunde liegenden Mechanismen der Methyl-CpG-bindende Domäne (MBD)-Proteinfamilie bei der Chromatinorganisation zu gewinnen. Zunächst habe ich die Phasentrennungseigenschaften, Funktionen und Dynamik der Proteine der MBD-Familie in vitro und in vivo charakterisiert. Ich fand heraus, dass die Proteine der MBD-Familie unterschiedliche Phasentrennungseigenschaften und Funktionen bei der Organisation der Chromozentren haben. MBD1∆CxxC3, eine Isoform, der die unmethylierte CpG-Bindungsdomäne CxxC3 fehlt, bildete unregelmäßige Aggregate, während MBD2, MBD3, MBD4 und MeCP2 unter bestimmten Bedingungen in vitro flüssigkeitsähnliche sphärische Tröpfchen bildeten. In vivo kolokalisierten MBD1, MBD2, MBD4 und MeCP2 mit den Chromozentren und förderten dosisabhängig die Chromozentren Clusterbildung. MBD1∆CxxC3 und MBD3 hingegen hatten keinen Einfluss auf die Größe der Chromozentren. Außerdem zeigte sich, dass MBD1, MBD1∆CxxC3 und MBD4 die Rundheit der Chromozentren verringerten, während die anderen MBD Proteine keinen Einfluss darauf hatten. Die Messung der Dynamik des Molekülaustauschs der MBDs zwischen den Chromozentren und der Umgebung ergab, dass alle MBDs sehr dynamisch sind. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die MBD Proteine sich wie folgt in ihrer Fähigkeit zur Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) unterscheiden: MeCP2 > MBD2 > MBD3 > MBD4 ≥ MBD1∆CxxC3. Ihre Auswirkung auf die Größe der Chromozentren war in absteigender Reihenfolge: MeCP2 > MBD4 > MBD2 > MBD1∆CxxC3 ≈ MBD3. Der Einfluss der MBD Proteine auf die Rundheit der Chromozentren war: (MBD3 >) MeCP2 > MBD2 > MBD4 > MBD1∆CxxC3. Bei der Proteinmobilität unterschieden sich die MBD Proteine wie folgt: MeCP2 < MBD2 < MBD1∆CxxC3 < MBD4. Bei den immobilen Fraktionen waren: MeCP2 ≈ MBD2 > MBD4 ≈ MBD1∆CxxC3. Die Organisation der Chromozentren könnte also durch die von den Proteinen der MBD-Familie vermittelte Phasentrennung reguliert werden. MBD2 und MeCP2 zeigen in vitro die besten Eigenschaften bei der LLPS und beeinflussen die Chromozentrenstruktur am stärksten. Im zweiten Teil dieser Thesis habe ich die funktionellen Unterschiede der MBD2-Isoformen in vivo und in vitro aufgeklärt. MBD2 hat drei Isoformen: MBD2a, MBD2b und MBD2c. MBD2a umfasst den N-Terminus, die MBD-TRD und den C-Terminus, während MBD2b und MBD2c die konservierte MBD-TRD Domäne, aber entweder keinen N-Terminus oder keinen C-Terminus aufweisen. Alle MBD2 Isoformen zeigten die Fähigkeit zur Phasentrennung, jedoch mit unterschiedlichen Eigenschaften. MBD2b zeigte in vivo und in vitro insgesamt ähnliche, aber schwächere Funktionen als die Isoform MBD2a. MBD2b war weniger stark in Chromozentren angereichert, förderte die Clusterbildung von Chromozentren in geringerem Maße und zeigte einen schnelleren Molekülaustausch zwischen den Chromozentren und der Umgebung. Im Vergleich zu MBD2a zeigte MBD2c eine ähnliche Moleküldynamik und Anreicherung in den Chromozentren, hatte aber keinen Einfluss auf die Größe der Chromozentren. In vitro bildete MBD2c nur unregelmäßige Aggregate. Der N-Terminus allein formte irreguläre Aggregate in allen getesteten Konditionen und zeigte die Fähigkeit, DNA zu rekrutieren. Die MBD-TRD allein formte keine Kondensate, sondern unregelmäßige Aggregate in Gegenwart von DNA. Der C-Terminus konnte abhängig von den Pufferkonditionen und unabhängig von anwesender DNA entweder unregelmäßige Aggregate oder sphärische Tröpfchen formen. Somit spielt die Polymer-Polymer-Phasentrennung (PPPS) eine Rolle bei der Funktion von MBD2, vor allem von MBD2c. Übereinstimmend mit diesen Beobachtungen, hatten auch hohe Level MBD2-MBD-TRD und MBD2c keinen Einfluss auf die Heterochromatinbeschäftigung, während hohe Level MBD2b die Ausweitung der Heterochromatinregion förderten. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass der N-Terminus für die Protein-DNA-Interaktion, die MBD-TRD für die PPPS und die Chromozentren Lokalisation und der C-Terminus für die LLPS verantwortlich ist. Die drei Isoformen von MBD2 weisen unterschiedliche funktionelle Eigenschaften auf, die auf eine Kombination der drei Regionen zurückzuführen sind. Im dritten Kapitel habe ich gezeigt, dass MeCP2 allein flüssigkeitsähnliche sphärische Tröpfchen durch Selbstinteraktion-induzierte LLPS bilden kann. Die Anreicherung von MeCP2 in den Tröpfchen in vitro und den Chromozentren in vivo war ähnlich. Die LLPS von MeCP2 wurde durch verschiedene Faktoren gefördert, die die physiologischen Bedingungen in vivo nachahmen. Die Anwesenheit von DNA förderte die LLPS von MeCP2 sowohl in Abhängigkeit von der DNA-Länge als auch von der Konzentration, indem sie zusätzliche Stellen für multivalente schwache Protein-DNA-Wechselwirkungen bereitstellte. Crowder förderten die LLPS von MeCP2, indem sie die lokale Proteinkonzentration erhöhten und die schwachen Wechselwirkungen durch den "excluded volume"-Effekt verstärkten. Die MeCP2-MeCP2- und MeCP2-DNA-Wechselwirkungen wurden durch das Auftreten einer begrenzten Diffusionspopulation in den Tröpfchen und in den Chromozentren charakterisiert. Cytosin-Methylierung schränkte die Größe der MeCP2-Kondensate in vivo und in vitro ein und führte zu einer eingeschränkten Gesamtmobilität. Die spezifische mC-DNA-Wechselwirkung trug zum Entstehen der statischen Population mit geringer bis statischer Diffusion in MeCP2-Kondensaten in vivo und in vitro bei. RTT-bedingte Nonsense-Mutationen veränderten die Phasentrennungseigenschaften von MeCP2. In vivo förderte MeCP2 die Clusterbildung von Chromozentren, die durch RTT-bezogene Nonsense-Mutationen stark abgeschwächt wurde. Die Phasentrennungseigenschaften und die Funktion von RTT-bedingten Nonsense-Mutationen bei der Chromozentren Clusterbildung sind negativ mit dem Schweregrad der Erkrankung von RTT-Patienten korreliert. RTT-bedingte Nonsense-Mutationen beeinflussen die Chromozentrum Organisation durch beeinträchtigte LLPS-Eigenschaften.

Diese Ergebnisse geben neue Einblicke in die Funktion und den zugrundeliegenden Mechanismus der MBD-Proteinfamilie in der Heterochromatin Organisation und tragen somit zum Gesamtverständnis der Phasentrennung im Zellkern bei.