Atgé Martin, Judith (2021)
Identifizierung von Zelleintrittsinhibitoren der Ebolavirus-Infektion und die Optimierung eines Impfvektors.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00019260
Dissertation, Erstveröffentlichung, Verlagsversion

Kurzbeschreibung (Abstract)

Eine Infektion mit dem Ebolavirus ist eine der tödlichsten Viruserkrankungen für den Menschen. Während des großen Ebolavirus-Ausbruchs der Jahre 2014 bis 2016 in Westafrika starben schätzungsweise 11 000 von 23 000 Infizierten. Bis heute kommt es immer wieder zu Ebolavirus-Ausbrüchen in der Demokratischen Republik Kongo. Hohe Ansteckungsraten und fehlende Therapiemöglichkeiten führten zu Mortalitätsraten bis zu 50% im Durchschnitt (WHO, 2020). Zunehmende Globalisierung und Mobilität der Menschen haben außerdem zur Folge, dass Ausbrüche des Ebolavirus nicht länger lokal begrenzt bleiben, sondern auch eine Verbreitung über mehrere Kontinente ermöglichen. Forscher fokussieren im Kampf gegen virale Krankheiten auf antivirale Therapeutika und Impfstoffe. Auch in der vorliegenden Arbeit wurde der Fokus auf diese beiden Ansätze gelegt. Während zwei Ebolavirus-Impfstoffe seit 2020 zugelassen sind, konnten noch keine Therapeutika basierend auf kleinen Molekülen/Peptiden identifiziert werden, die eine Bindung des Ebolavirus an Zellen unterdrücken. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit eine Hämofiltrat-Peptidbibliothek mithilfe von lentiviralen pseudotypisierten Ebolavirus-Vektorpartikeln mit einem Luziferase-Reportergen auf Zelleintrittshemer durchsucht. Innerhalb der 384 verschiedenen Peptidfraktionen konnten 5 verschiedene Peptidfraktionen als potentielle Ebolavirus-Zelleintrittshemmer identifiziert werden. Allerdings stellten sich diese Peptidfraktionen nach genaueren Analysen als Luziferase-hemmende Peptide heraus. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Optimierung des Impfvektors Modifiziertes Vakziniavirus Ankara (Modified Vaccinia Ankara-MVA). MVA ist ein etablierter und sicherer Impfvektor, dessen Wirksamkeit gegen zahlreiche Viren seit langem genutzt wurde. In humanen dendritischen Zellen synthetisiert MVA aber keine späten Genprodukte. Dies könnte an dem antiviralen Protein SAM Domäne und HD-Domäne beinhaltendes Protein 1 (SAM domain and HD domain-containing protein 1-SAMHD1) liegen. SAMHD1 reduziert den Pool an Deoxyribonukleotid-Triphosphaten im Zytoplasma von antigenpräsentierenden Zellen (antigen-presentating cells-APC) und damit die Neusynthese der viralen DNA. Die DNA-Replikation wird aber zur Expression von späten MVA-Genen bzw. den heterologen Antigenen benötigt, die unter starken späten MVA-Promotoren exprimiert werden. Ist die DNA-Replikation in APCs wiederhergestellt, kann die Expression später MVA-Gene bzw. der Antigene unter späten starken Promotoren stattfinden und diese somit direkt über den Haupthistokompatibilitätskomplex (Major compatibility complex-MHC) den T-Zellen präsentiert werden. Diese Wiederherstellung der DNA-Replikation kann durch den Abbau von SAMHD1 erfolgen. Virale Proteine wie das von HIV-2 und SIV exprimierte virale Protein x (virale Protein x-Vpx) sind bekannt dafür, SAMHD1 dem proteosomalen Abbau zuzuführen. Aus diesem Grund wurde in Vorarbeiten das SIV vpx Gen in das MVA-Genom eingeführt und folglich MVA-Vpx genannt. Für die Untersuchung der Vpx-Funktion wurden humane dendritische Zellen mit MVA-Vpx infiziert. Es konnte gezeigt werden, dass mit MVA-Vpx die DNA-Replikation, aber auch die späte Genexpression in humanen dendritischen Zellen wiederhergestellt werden kann. Da die späte Geenexpression zu einer verbesserten Vektorimmunogenität führen kann, erfolgten in dieser Arbeit vergleichende immunologische Untersuchungen. Diese beinhalteten die Reifung von MVA-Vpx-infizierten humanen dendritischen Zellen, welche anhand der CD80 (Cluster of Differentiation-CD), CD86-, MHCI- und MHCII-Expression, sowie der Sekretion der Zytokine Interleukin (IL)-6 und Tumor-Nekrose Faktor-(TNF)α untersucht wurde. Weitere vergleichende immunologische Untersuchungen erfolgten im Bezug auf die Interferonantwort. Zusätzlich wurde auch das Auslösen der Apoptose durch MVA-Vpx infizierte humane dendritische Zellen untersucht. Es deuteten sich Unterschiede in der Reifung von MVA-Vpx-infizierten und MVA-infizierten dendritischen Zellen an. Während es scheinbar Unterschiede bei der CD80 - und CD86-Expression zwischen MVA und MVA-Vpx infizierten humanen dendritischen Zellen gibt, scheint die MHC I -und MHC II-Expression ähnlich hoch zu sein. In der IL-6 und TNFα-Sekretion von MVA-Vpx-infizierten humanen dendritischen Zellen gab es keinen Unterscheid zu jener von MVA-infizierten humanen dendritischen Zellen. Die Apoptose wurde in MVA-Vpx-infizierten humanen dendritischen Zellen ähnlich schnell ausgelöst wie durch MVA-infizierte humane dendritische Zellen. Allerdings zeigten die Untersuchungen zur Interferonantwort Unterschiede. Die Interferon α - und – ß -Sekretion nach MVA-Vpx-Infektion von humanen dendritischen Zellen war deutlich reduziert zu jener Sekretion durch eine MVA-Infektion. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass in der vorliegenden Arbeit innerhalb der Peptidbibliothek aus humanen Hämolfiltrats kein Ebolavirus-Zelleintrittshemmer identifiziert werden konnte. Dennoch konnte die vorliegende Arbeit Einblicke in die Funktion des Impfvektors MVA-Vpx geben.

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