Knitsch, Regine (2021)
Mutationen in GvpA und GvpJ - Eine Mutationsanalyse zweier essentieller Gasvesikelproteine.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00018607
Dissertation, Erstveröffentlichung, Verlagsversion

Kurzbeschreibung (Abstract)

Um in hypersalinen Lebensräumen ihren Nährstoff- und Sauerstoffbedarf decken zu können sowie um in Bereiche mit hoher Lichtintensität zu gelangen, können viele Bakterien und Archaea, unter anderem Halobacterium salinarum, Gasvesikel bilden. Diese gasgefüllten, intrazellulären Nanostrukturen sind ausschließlich aus Protein aufgebaut und ermöglichen den Organismen eine passive Flotation an die Gewässeroberfläche. Das essentielle Protein GvpA (8 kDa) ist hierbei das Hauptstrukturprotein. Bis dato konnte noch keine Kristallstruktur von GvpA generiert werden, jedoch weist dessen Sekundärstruktur auf eine coil-α-β-β-α-coil Struktur hin, die durch solid-state NMR Analysen unterstützt wird. Mittels high-performance de novo Modellierung wurde zudem eine hypothetische 3D-Struktur erstellt. Auch GvpJ (12 kDa) gehört zu den essentiellen Gasvesikelproteinen, jedoch ist dessen Funktion bislang noch unbekannt. Die Aminosäuresequenz von GvpJ ähnelt zu 50% der von GvpA und auch hier deutet die Sekundärstruktur auf α-Helices und β-Faltblätter, ähnlich dem GvpA-Protein, hin. Um die Bedeutung einzelner Aminosäuren für die Gasvesikelbildung zu testen, wurden verschiedene Proteinmutanten hergestellt (GvpAMut und GvpJMut) und ihre Auswirkungen auf die Gasvesikelbildung in ∆A+AMut bzw. ∆J+JMut-Transformanten untersucht. Neben deren Einfluss auf die Gasvesikelbildung wurde auch ihr Einfluss auf die Gasvesikel-Morphologie analysiert. Hierbei wurden in dieser Arbeit zweiundsechzig Einzel- sowie zwei doppelte Aminosäuresubstitutionen innerhalb von GvpA und dreißig Aminosäuresubstitutionen in GvpJ analysiert. In GvpA führen die meisten Substitutionen innerhalb der ersten α-Helix zu Vac-negativen Transformanten. Besonders fällt auf, dass die Substitution aller geladener Aminosäuren zu Vac-negativen Transformanten führt. Nach dem hypothetischen Strukturmodell befinden sich diese auf der äußeren Oberfläche von GvpA und bilden dort vermutlich Salzbrücken mit anderen GvpA-Monomeren benachbarter Rippen. Eine Besonderheit ist hierbei R15, dessen Substitution generell zu Vac-negativen Transformanten führt und somit eine essentielle Aminosäure darstellt. Innerhalb der β-Faltblätter führt dagegen eine Alanin-Substitution der alternierenden, hydrophoben Aminosäuren zu Vac-positiven Zellen. Substituiert man diese jedoch durch geladene oder aromatische Aminosäuren (= hydrophile AS), führt dies zu Vac-negativen Zellen. Dies deutet darauf hin, dass weitere Ladungen die hydrophobe Innenoberfläche zerstören was mit einem Funktionsverlust des Gasvesikels einhergeht. Im Gegensatz dazu haben Substitutionen innerhalb der zweiten α-Helix kaum einen Effekt auf die Gasvesikelbildung, eher auf deren Morphologie. Über die hypothetischen Strukturabschnitte von GvpJ können dagegen keine solch übergreifenden Aussagen gemacht werden. Von den dreißig in dieser Arbeit eingeführten Substitutionen bilden nur acht Transformanten Gasvesikel, die meist wildtypähnlich sind. Nur ∆J+JE69A bildet zylindrische Gasvesikel und ∆J+JV25A und ∆J+JS34A besitzen instabile Gasvesikel. Alle restlichen Transformanten sind Vac-negativ. Vermutlich erzeugen die Substitutionen Konformationsänderung in GvpJ oder erschweren bzw. unterbinden sogar die Bindung zu anderen akzessorischen Gvp-Proteinen. GvpJ könnte daher in frühen Stadien der Gasvesikelbildung benötigt werden, wo es vermutlich Bestandteil eines initialen Proteinkomplexes ist.

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