Engel, Franziska Marianne (2021)
Die Rolle der kleinen RNA scr5239 in Streptomyces coelicolor.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00017527
Dissertation, Erstveröffentlichung, Verlagsversion

Kurzbeschreibung (Abstract)

Streptomyces coelicolor ist ein Modellorganismus für die GC-reichen, Gram-positiven Actinobakterien. Der Stamm gehört zu den am besten untersuchten Vertretern der Gattung der Streptomyceten. S. coelicolor hat einen sehr komplexen Lebenszyklus und muss sich als Bodenbakterium ständig an sich ändernde Umweltbedingungen anpassen. Diese Tatsache spiegelt sich unter anderem darin wieder, dass ca. 1000 der etwa 8000 annotierten Genen eine regulatorische Funktion zugeschrieben wurde. Unter diesen befinden sich 64 Sigma-Faktoren. Dazu gehören der Masterregulator PhoP, welcher die Phosphataufnahme steuert, GlnR, der den Stickstoffmetabolismus koordiniert und DasR, welcher als zentraler Regulator des Kohlenstoffmetabolismus gilt und die Verstoffwechselung der hauptsächlich in der natürlichen Umgebung vorkommenden Kohlenstoffquelle Chitin mit verschiedensten Prozessen in der Zelle verbindet. Im Gegensatz zur transkriptionellen Regulation ist die Regulation auf posttranskriptioneller Ebene in Streptomyceten bislang wenig untersucht. Die Rfam-Datenbank listet eine Vorhersage mit etwa 20 bekannten cis-regulatorischen Elementen auf. Zusätzlich dazu werden in Streptomyceten, wie auch in vielen anderen Organismen, immer mehr regulatorische RNAs identifiziert, deren genaue Funktion jedoch oft noch ungeklärt ist. Zu diesen gehören kleine nicht-kodierende RNAs (sRNAs – small non coding RNAs), welche eine wichtige Rolle bei der posttranskriptionellen Regulation spielen. Sie sind typischerweise 50-200 nt lang, strukturell sehr divers und zeigen eine große Varianz in ihrer Wirkungsweise und der Zielgene, die sie regulieren. Als Regulatoren der Translation binden sie in vielen Fällen komplementär den Bereich der Ribosomenbindestelle ihrer Ziel-mRNA, maskieren diesen und inhibieren so die Initiation der Translation. Die am besten untersuchete sRNA in Streptomyceten ist scr5239 in S. coelicolor. Sie ist upstream von ORF5239 kodiert, 159 nt lang und in etwa 2/3 aller bekannten Streptomycetengenome sowohl strukturell als auch in großen Teilen in ihrer Sequenz hoch konserviert. Zu Beginn dieser Arbeit waren bereits zwei Zielegene von scr5239 charakterisiert: dagA und metE, welche für eine Agarase und eine Methionin-Synthase kodieren. Ausgehend von einer Proteom-Analyse konnten in dieser Arbeit drei weitere Ziele für scr5239 identifiziert werden: pepck, mor und thiL welche für die Phosphoenolpyruvatkinase, die Malat-Oxidorduktase und die Acetyl-CoA-Acetyltransferase kodieren. Western-Blot- und RT-qPCR-Analysen zeigten, dass die sRNA die Expression dieser Ziele auf der posttranskriptionellen Ebene reprimiert. PEPCK, MOR und ThiL sind eng mit dem zentralen Stoffwechsel verbunden. PEPCK ist ein Schlüsselenzym des Primärmetabolismus, welches die Glykolyse mit dem Zitratzyklus verbindet, indem es die Umwandlung von Oxalacetat zu Phosphoenolpyruvat (PEP) katalysiert. MOR katalysiert die enzymatische Reaktion von Malat zu Pyruvat und ist essentiell in mehreren Teilen des Stoffwechsels, insbesondere im Zitratzyklus. ThiL katalysiert die Acetylierung von Acetyl-Coenzym A und deren Umkehrreaktion. Diese Reaktionen sind zum Auf- und Abbau von Ketonkörpern notwendig und sind somit ebenfalls eng mit dem Zitratzyklus verknüpft. Es konnte gezeigt werden, dass scr5239 durch die Regulation von pepck auch die intrazellulären PEP-Mengen beeinflusst. PEP spielt eine entscheidende Rolle in der Glykolyse und Glykoneogenese und ist damit ein Schlüssel-Intermediat des Kohlenstoffmetabolismus. Das Phosphotransferasesystem (PTS) von S. coelicolor nutzt PEP außerdem als Energiequelle für die Aufnahme und Phosphorylierung von N-Acetylglucosamin, dem Monomer von Chitin. Da die Expression des scr5239-Gens von DasR,dem Regulator des Kohlenstoffmetabolismus, welcher die Gene des PTS reguliert, abbhänging ist, lässt sich für scr5239 und DasR eine feedback-Regulation im zentralen Stoffwechsel beschreiben. Durch die katalytischen Funktionen der neu identifizierten Ziele und die feeback-Regulation von DasR konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass scr5239 eine zentrale Rolle im Stoffwechsel von S. coelicolor einnimmt.

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