CRISPR/Cas9-mediated genome engineering of the SMARCB1 gene locus

Lechler, Marion Brigitte (2021)
CRISPR/Cas9-mediated genome engineering of the SMARCB1 gene locus.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00011885
Dissertation, Erstveröffentlichung, Verlagsversion

URL / URN: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/11885

Kurzbeschreibung (Abstract)

Truncating or nonsense mutations in the ubiquitously expressed tumour suppressor gene and BAF chromatin remodelling complex core subunit SMARCB1 cause malignant rhabdoid tumours (MRTs) of the brain, kidney, and the soft tissues. MRTs show a high clinical variance despite a simple cancer genome with SMARCB1 being the only gene recurrently mutated in these malignancies. MRTs of the brain are called atypical teratoid/rhabdoid tumours (AT/RT) and present a rare, but highly aggressive brain tumour entity with poor prognosis that predominantly occur in very young children. In this thesis, diverse constructs for the generation of three-colour-reporter cell lines with SMARCB1 mutations found in AT/RTs were established and methods required for the CRISPR/Cas9-mediated genome engineering using these constructs were optimised. Heterozygous missense mutations or small in-frame deletions clustering in the last two exons of the SMARCB1 gene are frequently observed in another disease entity, Coffin Siris-syndrome (CSS). CSS is a congenital neurodevelopmental disorder characterised by cognitive impairment, microcephaly, coarse facial features, and hypoplasia of the fifth finger- and/or toenail as well of the distal phalanx of the fifth finger and/or toe. CRISPR/Cas9 constructs for the generation of hiPSC and MCF10A cell lines with heterozygous c.1091_1093del AGA SMARCB1 mutation were generated to investigate the cellular consequences of this mutation. Comparison of cellular AT/RT and CSS models would contribute to a better understanding of how different types of SMARCB1 mutations can lead to two very different diseases and how particular mutations affect the gene expression of SMARCB1 itself. The recently published mouse model recapitulating SMARCB1-associated features of CSS, which is based on a partial loss-of-function of Smarcb1, revealed a diminished pool of neural progenitor cells (NPC) in the developing brain of these mice. To test the hypothesis if overexpression of Hes5 can rescue the impairment in mouse neural stem cells (NSC) maintenance, a lentiviral system for the overexpression of Cre recombinase and of Hes5 in Smarcb1(+/flox) NSCs and NPCs was optimised.

Typ des Eintrags:

Dissertation

Erschienen:

2021

Autor(en):

Lechler, Marion Brigitte

Art des Eintrags:

Erstveröffentlichung

Titel:

CRISPR/Cas9-mediated genome engineering of the SMARCB1 gene locus

Sprache:

Englisch

Referenten:

Nuber, Prof. Dr. Ulrike A. ; Cardoso, Prof. Dr. M. Cristina

Publikationsjahr:

2021

Ort:

Darmstadt

Kollation:

X, 135 Seiten

Datum der mündlichen Prüfung:

10 September 2020

DOI:

10.26083/tuprints-00011885

URL / URN:

https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/11885

Kurzbeschreibung (Abstract):

Alternatives oder übersetztes Abstract:

Alternatives Abstract

Sprache

SMARCB1 ist ein ubiquitär exprimiertes Tumorsuppressorgen und eine Kernkomponente der chromatinremodellierenden BAF Komplexe. Inaktivierende Mutationen des SMARCB1 Gens sind die einzige wiederkehrende genetische Veränderung in malignen rhabdoiden Tumoren (MRT) des Hirns, der Niere und des weichen Gewebes. MRTs des Gehirns werden atypische teratoide/rhabdoide Tumore (AT/RTs) genannt und betreffen vorwiegend sehr junge Kinder. In dieser Arbeit wurden verschiedene Konstrukte erstellt um mit Hilfe der CRISPR/Cas9-Technologie Zelllinien mit drei Fluoreszenzreportern und Inaktivierung des SMARCB1 Gen zu erstellen. Methoden, die für diese CRISPR/Cas9-vermittelten Veränderungen im Genom benötigt werden, wurden etabliert und optimiert. Der Austausch oder Verlust einzelner Aminosäuren in der C-terminalen Region des SMARCB1 Proteins ist mit der Manifestation des Coffin Siris Syndroms (CSS) assoziiert. Das CSS ist eine angeborene Hirnentwicklungsstörung, die durch Verzögerungen in der geistigen Entwicklung, Mikrozephalie, und Hypoplasie des Nagels des kleinen Fingers und/oder Zehs sowie des letzten Gliedes des kleinen Fingers und/oder Zehs charakterisiert ist. Die am häufigsten beobachtete Mutation des SMARCB1 Gens in CSS ist die heterozygote Deletion des Lysins an Position 364 (c.1091_1093del AGA). Für diese Mutation wurde ebenfalls ein Fluoreszenzgen-gekoppeltes Modell in hiPSC und MCF10A Zellen entwickelt. Mit Hilfe dieser Modelle wird es möglich sein, die durch die Mutation des SMARCB1 Gens veränderten zellulären Prozesse und deren Auswirkung zu verstehen. Der Vergleich von Zellmodellen für AT/RTs und CSS kann dazu beitragen, besser zu verstehen wie unterschiedliche Mutationen desselben Gens zu verschiedenen Erkrankungen führen können und welchen Einfluss diese Mutationen auf das Genexpressionslevel von SMARCB1 haben. In dem kürzlich veröffentlichten Mausmodell, das SMARCB1-assoziierte Charakteristika von CSS rekapituliert und auf einem partiellen Funktionsverlust von Smarcb1 beruht, wurde eine reduzierte Zahl an neuralen Vorläuferzellen (NPCs) während der Hirnentwicklung beobachtet. Um die Hypothese zu testen, ob die Überexpression von Hes5 die durch Mutation des Smarcb1 Gens verursachten Veränderungen im Erhalt der neuralen Stammzellen (NSCs) ausgleichen kann, wurde ein System zur lentiviral vermittelten Überexpression der Cre Rekombinase und des Hes5 Gens in Smarcb1(+/flox) NSCs und NPCs optimiert.

Deutsch

Status:

Verlagsversion

URN:

urn:nbn:de:tuda-tuprints-118851

Sachgruppe der Dewey Dezimalklassifikatin (DDC):

500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie

Fachbereich(e)/-gebiet(e):

10 Fachbereich Biologie
10 Fachbereich Biologie > Stammzell- und Entwicklungsbiologie

Hinterlegungsdatum:

12 Feb 2021 07:46

Letzte Änderung: