Engemann, Victoria (2021)
Entwicklung zellbasierter Assays für die Evaluation von Chemokininhibitoren.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00017372
Dissertation, Erstveröffentlichung, Verlagsversion

Kurzbeschreibung (Abstract)

Chemokine (chemotaktische Cytokine) sind eine Klasse kleiner Signalproteine, die an verschiedenen Prozessen der Immunantwort beteiligt sind und eine angiogenetische oder angiostatische Wirkung haben können. Chemokine bilden im Organismus lösliche und immobilisierte Gradienten aus, anhand derer sich Immun- und Stammzellen orientieren können. Diese Zellen wandern entlang dieser Gradienten, wobei man im Fall der löslichen Gradienten von Chemotaxis und im Fall der immobilisierten Gradienten von Haptotaxis spricht. Die Überexpression oder fehlerhafte Regulation von Chemokinen führen zu verschiedenen Krankheiten. Dazu gehören verschiedene Autoimmunerkrankungen wie z.B. rheumatoide Arthritis oder Psoriasis und Krankheiten, bei denen eine übermäßige Rekrutierung von Immunzellen stattfindet, wie z.B. Arteriosklerose und Asthma. Aber auch bei der Metastasenbildung verschiedener Krebsarten und der Blutversorgung von Tumoren sind Chemokine beteiligt. Um genauere Einblicke in das Zusammenspiel löslicher und immobilisierter Gradienten verschiedener synergistisch und antagonistisch wirkender Chemokine zu erhalten, werden Systeme benötigt, mit denen Zellantworten auf einzelne oder mehrere Chemokine untersucht werden können. Um Chemokine, ihre Wirkung auf Zellen des Immunsystems und ihre Inhibition untersuchen zu können, werden große Mengen der entsprechenden Chemokine benötigt. Daher sollte im Rahmen dieser Arbeit eine entsprechende Reinigungsstrategie entwickelt werden. Da Chemokine ihre Rezeptoren über ihren N-Terminus aktivieren, ist es von großer Bedeutung, dass die gereinigten Chemokine über einen nativen N-Terminus verfügen. Es wurden daher drei verschiedenen Expressions- und Reinigungsstrategien mit und ohne His6-Tag getestet. Für die Evaluierung potentieller Chemokininhibitoren wird ein einfach durchzuführender plattenbasierter Assay benötigt, mit dem mehrere Proben gleichzeitig untersucht werden können. Da bei der Inhibition der Chemokine zur Modulation der Zellantwort von Leukozyten wichtig ist, dass der letzte Schritt der Signalkaskade, die Chemotaxis, inhibiert wird, sollte dieser Assay entweder die Chemotaxis selbst oder einen chemotaxisnahen Schritt in der Signalkaskade adressieren. Daher sollte im Rahmen dieser Arbeit ein in einer vorangegangenen Dissertation vorgestellter Assay weiterentwickelt werden, der die Aktinpolymerisation misst, die ein Bestandteil des molekularen Mechanismus der Chemotaxis ist. Im dritten Teil der Arbeit sollte ein mikrofluidisches System etabliert werden, mit dem das Zusammenspiel löslicher und immobilisierter Chemokingradienten untersucht werden kann. Zunächst wurde der Einfluss der Strömungsgeschwindigkeit auf den Verlauf des Gradienten untersucht. Anschließend wurden die Gradienten im Kanal immobilisiert. Um eine Immobilisierung der IL-8-Konzentrationsprofile im Kanal zu erreichen, wurde der Kanal mit Heparin beschichtet, um die natürliche Präsentation der Chemokine auf der Zelloberfläche nachzuahmen. Dabei wurde das Heparin mithilfe von Dopamin unter oxidativen Bedingungen kovalent an den Kanal gebunden. Anschließend wurden mit den immobilisierten Gradienten Zellmigrationsversuche durchgeführt, die eine signifikante Migration der Zellen auf den immobilisierten Gradienten zeigten.

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