Schneider, Jeannine (2021)
Goldnanopartikel-basierte Aptasensoren zum Nachweis von Antibiotika.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00017509
Dissertation, Erstveröffentlichung, Verlagsversion

Kurzbeschreibung (Abstract)

RNA-Aptamere sind kurze, einzelsträngige Nukleinsäuren, die über in vitro Selektionen (SELEX-Methode) gewonnen werden und einen Liganden hochaffin und spezifisch binden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Aptamere für den Aufbau von Nachweissystemen genutzt, um die Anwesenheit von unterschiedlichen Antibiotika zu detektieren. Sowohl Antibiotikarückstände in Nahrungsmitteln und Trinkwasser als auch Antibiotikafälschungen stellen eine immer größer werdende Belastung der Bevölkerung dar. Der Nachweis dieser ist folglich von großer Dringlichkeit und sollte zudem schnell, effizient und kostengünstig erfolgen. Deshalb wurden für den Aufbau der Nachweissysteme sowohl das Ciprofloxacin- als auch das Tobramycin-Aptamer verwendet. Beide Aptamere lagen zu Beginn dieser Arbeit charakterisiert vor. Die Dissoziationskonstanten, welche im niedrigen nanomolaren Bereich liegen, ermöglichen den späteren Nachweis von Antibiotikarückständen in Lebensmitteln, da die maximal erlaubten Rückstandsmengen sich oberhalb dieser Konstante bewegen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde ein druckbares Nachweissystem für Ciprofloxacin in Zusammenarbeit mit dem Druckinstitut für Druckmaschinen und Druckverfahren der TU Darmstadt entwickelt. Durch die Analyse verschiedenster Trägermaterialien und erster Untersuchungen zur Stabilität von Nukleinsäuren nach dem Druck konnte ein Papier-basierter Teststreifen entwickelt werden, welcher gedruckte und getrocknete Aptamere für den Nachweis von Ciprofloxacin enthielt. Der Nachweis des Liganden erfolgte dabei über die Eigenfluoreszenz von Ciprofloxacin. Es konnte gezeigt werden, dass RNA-Aptamere für längere Zeit auf Papier-basiertem Trägermaterial gelagert werden können und anschließend weiterhin Funktion zeigen. Die Nachweisgrenze kann dabei individuell festgelegt werden, solange das Aptamer in äquimolarem Verhältnis zum nachzuweisenden Ciprofloxacin eingesetzt wird. Ein Nachteil dieser Art von Nachweissystemen ist jedoch, dass sie auf eine Auswertung im Labor angewiesen sind und somit die Hilfe von technischen Geräten benötigen. Aus diesem Grund wurde im zweiten Teil dieser Arbeit ein Nachweissystem auf Basis von Goldnanopartikeln entwickelt. Diese Partikel besitzen die Eigenschaft, in dispergiertem Zustand rot und in aggregiertem Zustand blau zu erscheinen. Dieser Farbumschlag ist mit dem bloßen Auge erkennbar, weshalb die anschließenden Tests direkt im freien Feld einsetzbar wären und nicht auf die Zuhilfenahme von technischen Geräten angewiesen sind. Es folgte die ausgiebige Charakterisierung unterschiedlicher Goldnanopartikel und die Untersuchung von Einflüssen wie Temperatur und pH-Wert auf die Partikelstabilität. Mit den so gewonnenen Ergebnissen wurde ein erstes, kolorimetrisches Nachweissystem entwickelt, bei dem die Ciprofloxacin-Aptamere unspezifisch auf der Partikeloberfläche gebunden vorlagen. Die Ergebnisse zeigten jedoch, dass die Zugabe des Liganden zu keiner Farbänderung der Partikel führte, weshalb der Sensor als nicht funktionsfähig eingestuft wurde. Die Methode der Capture-SELEX ist eine Variation der klassischen SELEX, bei der jedes Aptamer eine kurze definierte Sequenz enthält, über die das Aptamer an ein sogenanntes Capture-Oligonukleotid gekoppelt werden kann. Die Zugabe des Liganden während der SELEX führt anschließend wieder zur Ablösung der Aptamere vom Capture-Oligonukleotid und zur Selektion dieser. Die Einbindung dieses Capture-Oligonukleotids in die Entwicklung eines Nachweissystems ermöglicht folglich ein modulares Nachweissystem für alle aus der Capture-SELEX hervorgegangenen Aptamere. In Kombination mit Goldnanopartikel würde zudem ein modulares Nachweissystem mit sichtbarem Farbumschlag ermöglicht werden. Mit Hilfe von verschiedenen Kopplungsmethoden konnte im Rahmen dieser Arbeit das Capture-Oligonukleotide auf der Partikeloberfläche von Goldnanopartikeln kovalent immobilisiert werden. Die anschließende Bindung des Tobramycin-Aptamers an die Capture-Oligonukleotide auf der Partikeloberfläche führte zu einer Art Schutzhülle um die Partikel, welche eine frühzeitige Aggregation verhinderte (rote Färbung der Partikel). Die Zugabe des Liganden Tobramycin führte anschließend zum Ablösen der Aptamere von den Capture-Oligonukleotiden, was einen Farbumschlag der Partikel von rot nach blau zur Folge hatte, der die Anwesenheit des Liganden signalisierte. Die Entwicklung eines ersten Prototyps zum Nachweis von Tobramycin war erfolgreich. In weiteren Versuchen muss die Übertragbarkeit auf andere Capture-SELEX-Aptamere geprüft und Experimente zur Verbesserung der Sensitivität durchgeführt werden. Die hohe Modularität des Systems sowie dessen einfache Handhabung machen dieses nun zu einem idealen Kandidaten für Goldnanopartikel-basierte Aptasensoren für den Nachweis von Antibiotikarückständen oder Antibiotikafälschungen. Eine Analyse der Marktfähigkeit solcher Nachweissysteme erfolgte parallel zu den Arbeiten im Labor durch eine Umfrage der Bevölkerung, an der 500 Probanden teilnahmen. Die Ergebnisse legten offen, dass der Großteil der Befragten bereits von Antibiotikarückständen in Lebensmitteln gehört hatte, jedoch nicht alle aufgrund dessen besorgt seien. Es zeigte sich jedoch, dass Schnelltests für den Nachweis solcher Rückstände eine potenzielle Marktlücke darstellen, da die Mehrheit der Befragten von diesen Gebrauch machen würde.

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