Survivin, das kleinste Mitglied der Inhibitor of Apoptosis Protein (IAP)-Familie ist durch eine hohe Expression in fast allen untersuchten humanen Tumoren gekennzeichnet. Obwohl Survivin primär als ein Protein mit Funktionalität in der Regulation von Apoptose und Zellzyklus/mitotischen Spindelkontroll- punkt beschrieben ist, wird das Protein aktuell als ein wesentlicher Knotenfaktor in einer Vielzahl zellulärer Reaktionskaskaden angesehen. In diesem Zusammenhang stellt Survivin in einer Vielzahl von Tumorentitäten einen Resistenzfaktor dar, der das Überleben der malignen Zellen nach Strahlenexposition verbessert indem er die Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DNA-DSB) zu modulieren vermag. Dabei konnte eine nukleäre Akkumulation von Survivin nach Bestrahlung mechanistisch mit der Aktivität der DNA-abhängigen Proteinkinase (DNA-PKcs), einer Schlüsselkomponente des DNA-DSB Reparatur- Mechanismus der Nicht-Homologen Endverknüpfung (NHEJ), assoziiert werden.

Ziel der Studie war die Aufklärung der molekularen Determinanten der Survivin-DNA-PKcs Wechsel- Beziehung durch computergestützte Analysen der Interaktionsregionen und biochemische Ansätze. Dazu wurden die Bindung kristallographischer 3D-Strukturen von Survivin und die katalytische PI3Kinase-Domäne der DNA-PKcs virtuell mit Hilfe fortgeschrittener Algorithmen und molekular-dynamischer Berechnungen simuliert und in Abhängigkeit von freien Bindungsenergien (ΔG) und der räumlichen Zugänglichkeit/physischen Nähe bewertet. Anschließend wurden als Ergebnis dieser Analysen unterschiedliche Aminosäuren von Survivin mutiert und die funktionellen Konsequenzen dieser Mutagenese mittels durchflusszytometrischer Förster-Resonanzenergietransfer (FACS-FRET) und Ko-Immunpräzipitations (co-IP) Experimenten untersucht. Das Überleben nach Bestrahlung und die Fähigkeit zur Reparatur von DNA-Schäden wurden mit 3-dimensionalen-Koloniebildungstests bzw. der Quantifizierung von DNA-Schadensmarker γH2AX/53BP1 analysiert, während die Effekte der Interaktion auf die Kinaseaktivität der DNA-PKcs durch in-vitro Kinase-Aktivitätsmessungen und Massenspektrometrie (LC-MS2/3) basierten multi-Proteomik-Ansätzen evaluiert wurden. Schließlich erfolgte mit Hilfe eines virtuellen Wirkstoff-Screening-Ansatzes auf Grundlage der Survivin-DNA-PKcs-Interaktion eine Suche nach neuartigen niedermolekularen Hemmstoffen der Interaktion mit möglicher strahlensensibilisierender Wirkung.

Durch molekulare Bindungs- und in-silico Analysen konnte eine Bindung von Survivin an die PI3Kinase-Domäne der DNA-PKcs nachgewiesen werden, die überwiegend durch eine Interaktion der Aminosäuren Serin (S)20 und Tryptophan (W)67 der Baculovirus-IAP repeat (BIR) Domäne von dimerisierten Survivin vermittelt wird. Im Vergleich zum Wildtyp (wt) Survivin verringerte eine spezifische Mutagenese dieser Aminosäuren signifikant die Interaktion mit der DNA-PKcs, korrelierte mit einer erhöhten Strahlen- sensibilität von kolorektalen Tumorzellen und einer verminderten DNA-Reparaturkapazität nach Hemmung von endogenem Survivin. Im Vergleich dazu konnte durch eine Überexpression von wt Survivin das klonogene Zellüberleben und die DNA-Reparaturkapazität wiederhergestellt werden. Darüber hinaus führten weiterführende molekulare Bindungsanalysen und dynamische Simulationen zur Entwicklung eines Heterotetramer-Modells, bei dem Survivin an die Oberfläche eines bereits existierenden DNA-PKcs-Dimers zu binden vermag. In Untersuchungen des Effekts dieser Bindung auf nachgeschaltete regulatorische Funktionen der DNA-PKcs konnte eine große Anzahl differentiell regulierter Phospho- peptide identifiziert werden, die vorwiegend Reaktionswegen der DNA-Schadensantwort/Reparatur betreffen. Dabei führt die Bindung von Survivin an ein präformiertes DNA-PKcs-Dimer zu einer Konformationsänderung der PI3K-Domäne, resultierte in einer signifikanten Steigerung der Kinaseaktivität und einer differentiellen Änderung der Substratspezifität. Insbesondere bisher wenig beschriebene DNA-PKcs S/T-Hydr (hydrophobe Aminosäuren: G, A, V, L, I, P, F, M, W) Motive einschließlich der FOXO3 Aminosäure S253 zeigten eine hohe Konservierung innerhalb der detektierten Phosphorylierungsstellen. Darüber hinaus zeigten Proteomanalysen, dass die Survivin-DNA-PKcs-Interaktion nicht nur post- translationale, sondern auch regulatorische Funktionen auf Proteinexpressionsebene ausüben kann. Schließlich konnten in ersten virtuellen Wirkstoff-Screening-Ansatz niedermolekulare Verbindungen identifiziert werden, die eine hohe Bindungsaffinität zu den Amiosäuren S20 und W67 aufweisen und für zukünftige strahlensensibilisierende Therapieansätze vielversprechend sein könnten.

Zusammenfassend konnte erstmals unter Verwendung einer Methodik zur Quantifizierung einer Proteineninteraktion in lebenden Zellen und durch in-silico strukturbasierte Bindungsanalysen spezifische Aminosäuren von Survivin identifiziert werden, die an der Wechselwirkung mit der PI3K-Domäne der DNA-PKcs beteiligt sind. Darüber hinaus bestätigen die Ergebnisse der Strahlensensibilitätsuntersuchungen, der Nachweis von DNA Reparatur-Foci, DNA-PKcs Aktivitätsmessungen und (Phospho)proteomik-Analysen die Vorstellung, dass Survivin einen (Fein)regulator der DNA-DSB Reparatur und insbesondere der Substratspezifität der DNA-PKcs hin zu S/T-Hydr-Motiven darstellt. Umfangreiche (Phospho)proteomik-Analysen führten zudem zur Aufdeckung neuer Kandidatenproteine und Phosphorylierungsstellen. Dies könnte dazu beitragen die zugrundeliegenden mechanistischen Beziehungen zwischen Survivin und DNA-PKcs weiter aufzuklären und den Weg zur Entdeckung neuer, Survivin-assoziierter Tumor und DNA-Schadenreaktionsmarkern und Therapieansätze zu ebnen.