Mertsch, Alexander (2020)
Evaluierung bakterieller Enzyme für die Synthese neuartiger neo-Sialokonjugate.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.25534/tuprints-00014124
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

Sialinsäuren bilden eine Familie von 9-Kohlenstoff-Zuckern mit einer α-Ketonsäurefunktionalität und sind durch ihre strukturelle Komplexität direkt mit zahlreichen biologischen Erkennungs- und Steuerungsprozessen assoziiert. Glycokonjugate, die terminale Sialinsäuren enthalten, sind omnipräsent in tierischen Glycanen wie Glycoproteinen und Glycolipiden und auf der äußersten Schicht der Zelloberfläche zu finden. Auf der anderen Seite können Sialokonjugate als biologische Maske für pathogene Bakterien fungieren, die sialinsäurehaltige Oligosaccharide produzieren, um sich vor dem Immunsystem des Wirts zu schützen oder als wirtseitige Andockstation für Viruspartikel dienen. Um die Funktionen und die biologische Bedeutung von Sialinsäuren und Sialokonjugaten in der Natur zu verstehen bzw. neuartige pharmazeutische Ansätze zu entwickeln, ist die Synthese von neuartigen neo-Sialokonjugaten ein unerlässlicher Ansatz. Um die Akzeptanz von Sialinsäurestrukturen mit strukturellen Variationen des terminalen C7–C9 Kohlenstoffrückgrats durch Enzyme des Leloir-Biosynthesewegs zu evaluieren, wurde eine Reihe neuartiger Sialinsäureanaloga synthetisiert. In einem neuartigen semisynthetischen Ansatz wurden, ausgehend von natürlicher N-Acetylneuraminsäure, über eine oxidative Spaltung des C7–C9 Rückgrats und darauffolgende Einführung nicht natürlicher Strukturmotive, chemoenzymatisch anderweitig nicht zugängliche Derivate und Analoga synthetisiert. Durch diastereoselektive Rekonstruktion des Rückgrats mittels Barbier-artiger Carboligation konnten vollständig diastereomerenreine Verbindungen mit gesättigten und ungesättigten sowie linearen und verzweigten und partiell desoxygenierten Alkylketten synthetisiert werden. Ebenso konnten Sialindisäuren und das erste verkürzte Legionaminsäureanalogon synthetisiert werden. Diese neuartigen Sialinsäuren wurden auf ihre Reaktionsfreudigkeit bezüglich der Nukleotidaktivierung durch die CMP-Sialat-Synthetase aus Neisseria meningitidis unter Verwendung eines pH-abhängigen Assays kinetisch analysiert. Über enzymatische Eintopfreaktionen wurden Nukleotidaktivierung und Sialyltransfer auf Lactose durchgeführt, um neuartige Trisaccharide als GM3 Analoga herzustellen, welche dann zur Testen der Substrattoleranz zweier bakterieller Neuraminidasen eingesetzt wurden. Für den Sialyltransfer wurde eine α2,3-Sialyltransferase aus Photobacterium phosphoreum JT-ISH-467 in einem Mutageneseansatz optimiert, um die hydrolytischen Aktivitäten dieses Enzyms durch gelenkte Evolution zu minimieren. In einer strukturbasierten Sättigungsmutagenese konnten drei Varianten mit bis zu 5-fach höherer katalytischer Effizienz für den Sialyltransfer (S359T / S360T) und bis zu 10-fach reduzierter Effizienz der Hydrolyse (L387A) gefunden werden. Als Variante mit dem effektivsten Profil wurde die Variante A151D identifiziert, die 4.3-fach reduzierter Hydrolyse und 1.9-fach gesteigerte Sialyltransfereffizienz zeigte. In einer NMR-Studie wurde schließlich bestätigt, dass die Sialidaseaktivität bei L387A bis zu 68-fach und bei A151D 26-fach reduziert ist.

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