Völkner, Kerstin (2020)
In vivo und in vitro Interaktionen haloarchaealer Gasvesikelproteine.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.25534/tuprints-00011850
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

Die p-vac Region aus Hbt. salinarum PHH1 besteht aus zwei entgegengesetzt orientierten Genclustern, gvpACNO und gvpDEFGHIJKLM, deren Expression zur Bildung von Gasvesikeln führt. Jedes dieser Gene kodiert für ein Gasvesikelprotein (Gvp). GvpA ist das Hauptstrukturprotein der Gasvesikelhülle und GvpC stabilisiert diese. Den Proteinen GvpD und GvpE wird eine regulatorische Rolle zugesprochen. Dabei fungiert GvpE als Transkriptionsaktivator und GvpD als -repressor. Die Proteine GvpFGHIJKLM sind hingegen akzessorische Proteine, die in einem frühen Stadium der Gasvesikelbildung in geringer Menge gebildet werden. Möglicherweise sind die meisten der akzessorischen Gasvesikelproteine in der Gasvesikelstruktur integriert, da alle, bis auf GvpK, in einer Gasvesikelpräparation nachgewiesen werden konnten. Auch sind sie, bis auf GvpH und GvpI, essentiell für die Bildung eines gasgefüllten Vesikels. In vergangenen Arbeiten wurde gezeigt, dass GvpM mit GvpH, GvpL oder GvpJ interagiert. Eine Interaktion von GvpM mit GvpG konnte nicht nachgewiesen werden. Diese Untersuchungen wurden in vitro mit heterolog in E. coli produzierten HisGvp-Fusionsproteinen unter denaturierenden Bedingungen durchgeführt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die von Tavlaridou et al. begonnenen Interaktionsstudien fortgeführt. Bei der Reinigung der HisGvp-Fusionsproteine zeigten sich eine Vielzahl von Co-Präzipitaten in den Coomassie-Färbungen. Bei der Durchführung der Pulldown-Assays und anschließenden Western-Analysen wurden darüber hinaus Kreuzreaktionen der verwendeten Gvp-Antiseren gegenüber den HisGvp-Fusionsproteinen festgestellt. Aus diesem Grund konnten keine eindeutige Aussage über Interaktionen getroffen werden. Daher wurde eine Methode etabliert, die den Nachweis von Protein-Protein Interaktionen unter nativen Bedingungen ermöglicht. Hierfür wurde die Cellulose-Bindedomäne (CBD) aus Clostridium thermocellum verwendet, da diese auch unter Hochsalzbedingungen stabil ist. Mit Hilfe dieser ist es nun erstmals möglich, Gasvesikelproteine in hoher Reinheit, ohne die Co-Präzipitation von Kontaminanten, zu isolieren. Zum Nachweis der Protein-Protein Interaktionen wurden die CBDGvp-Fusionsproteine gemeinsam mit dem putativen Interaktionspartner in Hfx. volcanii synthetisiert und das Gesamtzelllysat über eine Cellulosematrix gereinigt. Die Ergebnisse der Western-Analysen zeigten, dass alle akzessorischen Gasvesikelproteine miteinander interagieren. Lediglich der Interaktionsnachweis von GvpL mit GvpH oder GvpI war uneindeutig. Diese Ergebnisse verifizieren die Ergebnisse von Tavlaridou et al. und zeigen zudem eine Interaktion zwischen GvpG und GvpM. Darüber hinaus wurde die CBD-Methode zum Nachweis eines putativen Proteinkomplexes aus all diesen Gvp-Proteinen verwendet. Dazu wurde GvpM mit der CBD fusioniert und zusammen mit den sieben akzessorischen Gasvesikelproteinen GvpF, GvpG, GvpH, GvpI, GvpJ, GvpK und GvpL in Hfx. volcanii co-synthetisiert. Dabei fungierte CBDM als bait (Räuber) Protein und die Proteine GvpF bis GvpL als prey (Beute) Proteine. Die Western-Analysen des Pulldown-Assays zeigten, dass alle akzessorischen Gasvesikelproteine mit CBDM isoliert werden konnten. Dieses Ergebnis deutet daraufhin, dass die akzessorischen Gasvesikelproteine möglicherweise einen oder mehrere Proteinkomplexe bilden können. Zusätzlich wurden die Protein-Protein Interaktionen der akzessorischen Gasvesikelproteine und GvpA direkt in vivo mittels split-GFP untersucht. Die Methode beruht auf dem Prinzip, dass das salzstabile und modifizierte grün fluoreszierende Protein mGFP2 in zwei Teile zerlegt und die resultierenden Fragmente NGFP und CGFP jeweils an die putativen Interaktionspartner fusioniert wurden. Interagieren die beiden fusionierten Proteine (und gibt es keine sterischen Behinderungen), können beide GFP-Teile zu einem funktionalen Protein assemblieren. Die Interaktionsstärke kann schließlich über die relative Fluoreszenz (rf) ermittelt werden. Mit Hilfe dieser Methode konnten viele Interaktionen bestätigt und ein erstes Interaktionsnetzwerk der akzessorischen Gasvesikelproteine erstellt werden. Zudem zeigte sich, dass GvpA nur mit GvpF interagiert und dass GvpL womöglich eine zentrale Rolle im Proteinkomplex der akzessorischen Gasvesikelproteine spielt. Darüber hinaus wurden die Interaktionsstellen in GvpM zu anderen Gvp-Proteinen näher definiert. Dazu wurden GvpM-Fragmente verwendet, die den N-terminalen Bereich (M25N) und den C-terminalen Bereich (M25C) repräsentieren und jeweils auf Interaktion mit den Proteinen GvpF bis GvpL hin untersucht. M25N interagierte hauptsächlich mit GvpI und GvpL und M25C hauptsächlich mit GvpF, GvpG, GvpH, GvpJ oder GvpK. Auch wurden bereits vorhandene GvpM-Deletionsvarianten auf Interaktion mit GvpF und GvpL untersucht, die ebenfalls zeigten, dass der N-terminale Bereich von GvpM wichtig für die L/M-Interaktion ist, während der C-terminale Bereich wichtig für die F/M-Interaktion ist. Um die Interaktionsstellen auf einzelne Aminosäuren eingrenzen zu können, wurden GvpM-Varianten hergestellt und sowohl auf Gasvesikelbildung als auch auf Interaktionsfähigkeit mit GvpL untersucht. Durch den Vergleich der Auswirkung auf die Gasvesikelbildung und der Interaktionsfähigkeit mit GvpL wurden zwei Motive in GvpM identifiziert, die für die L/M-Interaktion von Bedeutung sind: das PETI-Motiv in der putativen α-Helix 1, und das GAV/RAAIA-Motiv in den loops zwischen α-Helix 1 und β-Faltblatt 1 und zwischen dem β-Faltblatt 2 und der α-Helix 2. Aminosäuresubstitutionen in diesem Bereich haben in den meisten Fällen sowohl einen negativen Effekt auf die Gasvesikelbildung als auch einen positiven Effekt auf die L/M-Interaktion. Offenbar hat eine verstärke L/M-Interaktion einen negativen Einfluss auf die Gasvesikelbildung.

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