Brahm, Kevin (2020)
Untersuchung von Peptidomimetika als Inhibitoren für das Chemokin CXCL8.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.25534/tuprints-00011794
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

Als kleine Signalmoleküle des Immunsystems spielen Chemokine eine essentielle Rolle bei einer Vielzahl von chronisch entzündlichen Krankheiten und Autoimmunerkrankungen. Die Inhibition der Wechselwirkung dieser Moleküle mit ihren korrespondierenden Rezeptoren ist daher eine wichtige Strategie in der Entwicklung neuer Pharmazeutika zur Therapie dieser Entzündungserkrankungen. Ein Ansatz zur Chemokininhibition sind Peptide, die von diesen Rezeptoren abgeleitet werden und damit die Protein-Rezeptor-Wechselwirkung nachahmen und inhibieren können. In vorangeganenen Arbeiten wurde mit Hilfe von molekularem Modeling ein Peptid entwickelt, das einen Teil der Bindungsstelle des CXCL8 Rezeptors CXCR1 nachahmt. Dieses Peptid, IL8RPLoops, besteht aus zwei verknüpften Sequenzen aus der zweiten und dritten extrazellulären Schleife der Rezeptors, die ausreichend lang sind, um jeweils eine helikale Windung auszubilden. Es bindet mit submikromolarer Affinität an das Chemokin CXCL8. Wir vermuteten, dass die Vororientierung dieses Peptids in Lösung zu einer Rezeptor-ähnlichen Konformation für die relativ hohe Bindungsaffinität des linearen Peptids verantwortlich ist. Weitere Untersuchungen ergaben, dass am C-terminalen Ende des Peptids Glutaminsäure, statt Glutamin inkorporiert wurde und dieser durch Desamidierung hervorgerufene Austausch die Ausbildung sekundärer Strukturen des freien Peptids begünstigte. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde daher die Auswirkung bestimmter Sekundärstrukturelemente des aus CXCR1 abgeleiteten Peptids auf seine Affinität untersucht. Durch Austausch von helixbildenden Peptidbausteinen mit helixbrechenden Peptoidbausteinen mit gleichen Seitenketten wurde deren Einfluss auf die Struktur des potentiell vororientierten IL8RPLoopsE Peptids untersucht und mit der Auswirkung analoger Austausche an einem unstrukturierten Peptid verglichen, das aus dem N-Terminus des gleichen Rezeptors abgeleitet wurde und damit den anderen Teil der Bindungsstelle nachahmt. Bei Varianten des von vornherein unstrukturierten Peptids führten die helixbrechenden Reste zu einer Abschwächung der Bindungsaffinität, während helixbrechende Reste des IL8RPLoops Peptids diese vollständig verloren. Im CD-Spektrum dieser Varianten waren keine alpha-helikalen Anteile erkennbar. Es wurden MD-Simulationen durchgeführt, um Voraussagen über die Vororientierung der IL8RPLoops Derivate zu treffen. Dabei zeigte sich, dass die Termini von IL8RPLoopsE im Vergleich zu IL8RPLoopsQ sehr nah beieinander liegen und über Wasserstoffbrücken miteinander wechselwirken, so dass ein nicht-kovalenter Zyklus in Lösung vorliegt. Um den Einfluss dieser zyklischen Konformation auf die Bindungseigenschaften der beiden Peptide zu untersuchen, wurden diese durch orthogonale side-chain-to-tail Makrozyklisierung modifiziert. Die kovalente Zyklisierung erhöhte die Affinität des bindenden, linearen Peptids nur leicht, während die vorher nicht-bindende Variante nach Zyklisierung nun fast die gleiche Affinität aufwies. Beide zyklisierten Peptide zeigten in Fluoreszenzanisotropie-Messungen eine hohe Anisotropie, die bei Bindung an CXCL8 sank. MD-Simulationen wiesen darauf hin, dass der Fluorophor, der an einem flexiblen Linker verknüpft war, mit dem Peptid-Makrozyklus interagierte und bei Bindung des Peptids an das Chemokin verdrängt wurde. Die daraus resultierende Beweglichkeit des Fluorophors führt zu niedriger Fluoreszenzanisotropie, ein Effekt der als „Propeller-Effekt“ bekannt ist. Die Makrozyklisierung der Peptide hatte außerdem im Vergleich zu den linearen Varianten eine Erhöhung der Stabilität gegenüber proteolytischem Abbau zur Folge. Im zweiten Teil der Arbeit sollten Peptidomimetika aus kombinatorischen Bibliotheken identifiziert und weiterentwickelt werden. Die Mix-and-Split Synthese ist eine Strategie, um schnell und einfach eine große und diverse Anzahl von Substanzen zu synthetisieren, die bindende und inhibierende Eigenschaften gegenüber einem Zielprotein aufweisen können. Das Screening einer solchen One-bead-one-compound (OBOC) Bibliothek ist nicht trivial und häufig mit kostspieligen Strategien und Gerätschaften verbunden. Es wurden daher in dieser Arbeit eine Methode, basierend auf zwei-Kanal-Fluoreszenzmikroskopie und eine Methode basierend auf modifizierten Magnetpartikeln validiert, die ein einfaches und kostengünstiges Screening dieser Substanzbibliotheken ermöglichen können. Zur Methodenentwicklung wurde eine Auswahl an Streptavidin bindenden Peptiden auf TentaGel-HMBA-Syntheseharzsynthetisiert und am Harz entschützt. Diese Peptide deckten ein weites Spektrum von Bindungsaffinitäten, als auch andere physikochemische Eigenschaften, wie Nettoladung und Länge der bindenden Sequenz, ab, um eine Aussage über die Anwendbarkeit und Mindestaffinität für die Detektion beider Verfahren treffen zu können. Im fluoreszenzbasierten Verfahren wurden diese Peptide mit fluoreszent-markiertem Streptavidin inkubiert und mit kurzer Belichtungszeit im RHO und FITC-Kanal des Fluoreszenzmikroskops fotografiert, um das Photobleaching zu minimieren. Sekundäre Wechselwirkungen durch elektrostatische Interaktion der mit Peptiden funktionalisierten Partikel und des fluoreszenzmarkierten Proteins wurden durch Variation des Farbstoffs und Kontrollpartikel ausgeschlossen. Die resultierende Methode ist dafür geeignet, kurze Sequenzen, die im niedrigen mikromolaren Bereich an das Zielprotein binden, zu identifizieren. Sie wurde in nachfolgenden Arbeiten dafür verwendet eine Bibliothek von linearen Peptoid-Hexameren erfolgreich gegen CXCL8 zu screenen und im Anschluss daran 17 Hits zu identifizieren und zu charakterisieren. Im Magnetpartikel-basierten Verfahren wurde die gleiche Auswahl von immobilisierten Peptiden mit Streptavidin-beschichteten Magnetpartikeln behandelt, wobei die Partikel der Biotin-Positivkontrolle und der am stärksten bindende Sequenz ausreichend mit Magnetpartikeln beladen werden konnten, um im Magnetfeld eines Handmagneten mobilisiert zu werden. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass die Streptavidin-Magnetpartikel mit biotinyliertem CXCL8 beladen und anschließend zur Abtrennung von CXCR1 transfizierte HEK293-Zellen aus einer Suspension und neutrophilen Granulozyten aus Vollblut verwendet werden können. Schließlich wurde eine OBOC-Bibliothek aus 100 000 verschiedenen makrozyklisierten pentameren Peptoiden synthetisiert und mit Hilfe des magnetpartikelbasierten Verfahrens 22 CXCL8 bindende Partikel aus dieser isoliert. Die Sequenzierung und Charakterisierung dieser Liganden ist Bestandteil nachfolgender Arbeiten. Da die Makrozyklisierung in dieser Arbeit bereits bei CXCL8 bindenden Peptiden zu einer Erhöhung der konformationellen Rigidität und Bindungsaffinität geführt hatte, wurde diese Strategie auch auf die linearen Hexapaptoide aus dem Screening mit 2-Kanal Fluoreszenzmikroskopie angewandt. Es wurde eine on-bead Makrozyklisierung und Fluoreszenzmarkierung dieser 17 Peptoide über zwei zusätzlich am C-Terminus eingeführte orthogonal geschützte Lysinreste durchgeführt. Die resultierenden TAMRA-markierten makrozyklischen Peptomere zeigten ebenfalls den oben beschriebenen „Propeller-Effekt“, und es konnte eine Erhöhung der Bindungsaffinitäten zu CXCL8 um etwa eine Größenordnung im Vergleich zu den entsprechenden linearen Sequenzen nachgewiesen werden.

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