Die Anzahl an Krebsdiagnosen weltweit steigt stetig und Wissenschaftler verschiedener Disziplinen sind dadurch gefordert, innovative, effiziente und patientenfreundliche Therapien zu entwickeln. Unter anderem erwiesen sich Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) als eine vielversprechende Strategie zur Behandlung von Krebs, welche durch die Konjugation von potenten, organischen Molekülen an tumour-spezifische Immunglobuline generiert werden. In den letzten Jahrzehnten wurde eine Vielzahl chemischer und enzymatischer Methoden entwickelt, um die präzise Modifikation von Antikörpern zu ermöglichen. Das Enzym mikrobielle Transglutaminase (mTG) aus Streptomyces mobaraensis, welches natürlicherweise Isopeptidbindungen zwischen Glutamin- und Lysinseitenketten bildet, wurde unlängst für die Erzeugung von ADCs verwendet. Leider können natürlich vorkommende Aminosäuren humaner Antikörpern jedoch nicht mittels mTG-adressiert werden. Diese Einschränkung kann umgangen werden indem entweder peptidische Erkennungssequenzen auf genetischer Ebene in die natürliche Sequenz des Antikörpers eingefügt werden oder die Zuckerseitenkette der CH2-Domäne entfernt wird, wodurch Gln295 als Markierungsstelle verfügbar wird. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Optimierung der mTG-vermittelten Katalyse für die effiziente und schnelle Erzeugung von ADCs, wobei sowohl das eingesetzte Enzym als, auch der adressierte Antikörper modifiziert werden. Zu diesem Zweck wurden drei verschiedene Studien durchgeführt: (1) Mikrobielle Transglutaminase ist ein nützliches Werkzeug für die Vernetzung unterschiedlichster Zielmoleküle, da es stabile Isopeptidbindungen zwischen Glutaminresten und primären Aminen bilden kann. Ein Zugang zu maßgeschneiderten Transglutaminasen wäre jedoch wünschenswert, da die bis heute nicht vollständig verstandene Substratspezifität des Enzymes zu heterogener Produktbildung führen kann. Dieser Teil der vorliegenden Arbeit konzentriert sich auf die Entwicklung eines Verfahrens zur Optimierung von mTG mittels Hefeoberflächendisplay (YSD) und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS), um Varianten mit erhöhter Aktivität und veränderter Substratspezifität aus einem großen Spektrum zufallsmäßig generierter Mutanten, zu identifizieren. Aufgrund seiner intrazellulären Toxizität wurde mTG als inaktives Zymogen auf der Oberfläche von Saccharomyces cerevisiae Zellen präsentiert, welches anschließend durch Zugabe unterschiedlicher Proteasen in das reife Enzym umgewandelt wurde. Nach Zugabe des biotinylierten Glutamin-Donor-Peptids LLQG, katalysiert das oberflächenverankerte Enzym die Transamidierung des supplementierten Substrats an räumlich verfügbaren Lysinresten und ermöglicht so die Identifizierung aktiver Varianten aus einer Mischung mit inaktiven Varianten. Anschließend wurde eine randomisierte Bibliothek mit 3×108 verschiedenen Mutanten erzeugt. Nach fünf Runden FACS-Durchmusterung gegen das Substrat Biotin-GSGLLQG wurden 150 einzelne Klone auf der Oberfläche von Hefezellen analysiert und mit dem Wildtyp-Enzym verglichen. Nach rekombinanter Expression zeigten sechs Mutanten einen verbesserten Umsatz des entsprechenden Peptids in einem HPLC-basierten Assay. Des Weiteren, markierte die dreifach Mutante R5.2 (S2G/R15C/M234L) den therapeutischen Antikörper Trastuzumab, welcher eine LLQG Erkennungssequenz trug, effizienter als die Wildtyp-Referenz. Durch optimierte Transglutaminasen mit erhöhter katalytischer Leistung könnten die Kopplungseffizienz und die Ausbeuten bei der ortsspezifischen Konstruktion von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten verbessert und dadurch deren Produktionskosten gesenkt werden. (2) Neben der Optimierung des verwendeten Enzyms kann ebenfalls die genetisch inkorporierte mTG-Erkennungssequenz verbessert werden, um eine effizientere Katalyse zu erreichen. Die Reaktivität des Enzyms wird durch die Ladung und die Polarität der Aminosäuren, die das adressierte Glutamin umgeben, sowie der räumlichen Anordnung dieser Sequenz innerhalb des Zielproteins, beeinflusst. In früheren Arbeiten konnten Siegmund und Kollegen zeigen, dass natürliche Glutamin-Donor-Stellen intrinsischer mTG-Substrate nachgeahmt werden können um die Modifikation von therapeutischen Antikörpern mittels mTG zu ermöglichen. In diesem Teil der vorliegenden kumulativen Arbeit sollen Erkennungssequenzen, die die effiziente Markierung von Antikörpern ermöglichen, von den intrinsischen mTG-Substraten Dispase-Autolyse-induzierendes Protein (DAIP) und Streptomyces-Papain-Inhibitor (SPIP) abgeleitet werden. Zu diesem Zweck wurden Sequenzen, die vom Gln6 des SPIP, sowie von Gln39 und Gln298 des DAIP abstammen, mittels mikrowellenunterstützter Fmoc-Festphasenpeptidsynthese (SPPS) als Oligopeptide synthetisiert, und ihre Umsetzung durch mTG mit verschiedenen Linkersubstraten bestimmt. Nach der C-terminalen Fusion der jeweiligen Sequenzen an die schwere Kette des HER2-targetierenden Antikörpers Trastuzumab, wurde die mTG-vermittelte Modifikation der resultierenden Konstrukte mit dem Modellsubstrat N-(Biotinyl) Cadaverin (MBC) untersucht. Die von SPIP abgeleitete Sequenz DIPIGQGMTG (SPI7G) zeigte in vorhergegangenen Experimenten eine hohe Reaktivität und wurde aufgrund dessen für die Erzeugung eines ADC durch chemo-enzymatische zweischritt-Synthese, ausgewählt. Die C-terminal modifizierten Antikörper wurden in einer zeitlich stark begrenzen Reaktion mittels mTG mit N-[(1R,8S,9s)-bicyclo[6.1.0]non-4-in-9-ylmethyloxycarbonyl]-1,8-diamino-3,6-dioxaoctan (NH2-PEG2-BCN) modifiziert. Anschließend wurden die BCN-modifizierten Antikörper mittels SPAAC (strain-promoted alkine-azide cycloaddition) mit dem zytotoxischen Wirkstoff Monomethylauristatin E (MMAE) ausgerüstet, um das Wachstum HER2-überexprimierender Brustkrebszellen selektiv zu hemmen. Aufgrund der verbesserten Markierungseffizienz, war ein ADC der ausgehend von der neu identifizierten Sequenz SPI7G zusammengesetzter wurde, wesentlich wirksamer gegen HER2-positive SKBR3-Zellen als eine Referenz mit dem herkömmlichen LLQG-Motiv. Es konnte gezeigt werden, dass intrinsische mTG-Substrate einfach als Quelle für potente Erkennungssequenzen genutzt werden können. Innerhalb einer stark eingeschränkten Reaktionszeit von 1 h, wurde die neue Sequenz SPI7G am C-Terminus der schweren Kette von Trastuzumab, fünffach effizienter mit dem Molekül NH2-PEG2-BCN modifiziert als der LLQG-markierte Referenzantikörper. Für die mTG-vermittelte Erzeugung von ADCs werden typischerweise Reaktionszeiten von >16 h angewandt wobei es zu unerwünschten Schädigungen durch lange thermische Belastung, und somit Verringerung der Ausbeute kommen kann. Eine verkürzte Reaktionszeit, die durch effizientere Erkennungssequenzen ermöglicht wird, könnte diese Gefahr minimieren und somit den gesamten Prozess der mTG-vermittelten ADC Generierung verbessern. (3) Der Einbau von spezifischen mTG-Erkennungssequenzen in das Grundgerüst von Antikörpern ist eine bewährte Methode für deren Markierung mit unterschiedlichen Zielmolekülen. Längere Sequenzen können jedoch die intrinsische Stabilität des Antikörpers beeinträchtigen und eine Immunantwort des Patienten während der Behandlung auslösen. In diesem Teil der vorliegenden kumulativen Arbeit wurden verschiedene Positionen eines humanen IgG Fc (fragment crystallisable) untersucht um Positionen zu identifizieren, die nach Austausch gegen Glutamin eine Markierung mittels mTG ermöglichen. Durch den Austausch einer einzelnen Aminosäure soll das potenzielle Risiko von Immunogenität und Instabilität im Vergleich zu langen Erkennungssequenzen, verringert werden. Zuerst wurde eine einfache Strategie für die rekombinante Expression des Antikörper Fc in E. coli-Zellen etabliert. Das Fragment wurde in ausreichenden Mengen durch Ni2+-Affinitätschromatographie gereinigt und mittels nichtreduzierender SDS-PAGE, Thermal Shift Assays und Flüssigchromatographie-gekoppelter Massenspektrometrie hinsichtlich seiner strukturellen Integrität untersucht. Mithilfe von ortsgerichteter Mutagenese wurden Glutamin-Austausche innerhalb des Fc eingeführt und deren Markierung durch mTG in einem Fluoreszenz-basierten Assay untersucht. Von den 30 untersuchten Positionen wurden zwei Varianten (I253Q und Y296Q) mit einem fluoreszierenden Amin-Substrat durch mTG markiert. Diese vielversprechenden Ergebnisse müssen im Kontext eines vollständigen Antikörpers bestätigt werden, um ihren Nutzen für die mTG-vermittelte Konstruktion von ADCs zu belegen.