Die derzeit auf dem Markt befindlichen Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs - Antibody drug conjugates) wurden durch unspezifische Konjugation eines Wirkstoffs mit Lysin- oder Cysteinseitenketten innerhalb des Antikörpers erzeugt. Diese unspezifische Konjugationsmethode führt zu einem heterogenen Produkt und kann die Bindefähigkeit des Antikörpers beeinträchtigen, wenn die Konjugation innerhalb von Sequenzabschnitten stattfindet, die für die Bindung an die Zielstruktur essentiell sind. Da die Anzahl und die Konjugationsstelle die Wirksamkeit, Immunogenität und Pharmakokinetik eines ADC beeinflusst, wurden verschiedene ortsspezifische Konjugationsstrategien entwickelt, darunter die Verwendung von unnatürlichen Aminosäuren und enzymatisch vermittelten Konjugationsstrategien. Neuere Forschungsarbeiten befassen sich mit steigenden Wirkstoff-Antikörper-Verhältnissen (DARs – Drug-to-antibody ratios), da ein hohes DAR die Wirksamkeit insbesondere gegenüber Zellen mit geringer Anzahl von oberflächenpräsentierten Zielproteinen verbessern kann. Allerdings gehen hohe DARs mit zunehmender Hydrophobizität einher. Dies führt zur Aggregation des ADC und seiner schnellen Entfernung aus dem Körper, wodurch sich die Wirksamkeit des ADC verringert. Hydrophile Linker- oder Wirkstoffderivate, sowie die Verwendung von biokompatiblen, hydrophilen Gerüsten, an welche die toxische Substanz gekoppelt ist, verbessern die Löslichkeit und verringern die Aggregation von ADCs mit hohem DAR. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Herstellung von ADCs mit hohem DAR unter Verwendung von Polypeptid-basierten Gerüsten. Diese genetisch codierbaren Sequenzen bieten die Möglichkeit einer genetischen Fusion und enzymatisch vermittelten Konjugation mit einem Antikörper. Die genetische Fusion mit dem Modellantikörper Trastuzumab wurde durch Verwendung der hydrophilen PAS-Sequenz, welche mit mTG Erkennungssequenzen ausgestattet wurde, oder intrinsisch unstrukturierten Regionen/Polypeptiden erreicht. Diese Antikörperfusionen wurden nach ihren Bindungseigenschaften, ihrer Stabilität und ihrer mTG Reaktivität charakterisiert. Die durch mTG vermittelte Markierungsreaktion gewährleistete die ortsspezifische Modifikation und die Bildung eines homogenen Produkts. Dafür wurden aus der Natur abgeleitete mTG Erkennungsmotive untersucht und eine optimierte Sequenz für die effiziente Konjugation identifiziert, die in Zukunft die Erzeugung von ADCs mit hohem DAR ermöglichen kann. Keines der produzierbaren Antikörperfusionen zeigte eine signifikante Beeinträchtigung der Bindefähigkeit. Allerdings war die mTG vermittelte Konjugationseffizienz bei den meisten Trastuzumab-Fusionen gering. Zudem konnte der Abbau der ungeordneten Sequenzen beobachtet werden. Auch nach Zugabe verschiedener Additive wie EDTA und Natriumazid zur Stabilisierung der PAS-Fusionen, konnte der Abbau innerhalb weniger Tage beobachtet werden. Da ungeordnete Sequenzen besonders anfällig für proteolytischen Abbau sind, wurde stattdessen ein strukturiertes Protein mit Trastuzumab fusioniert, was zu einem stabilen, aber schwer durch mTG markierbaren Fusionsprotein führte, das im Vergleich zum Wildtyp Antikörper ähnliche Bindungseigenschaften aufwies. Für einen alternativen Ansatz zur Herstellung von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten, die eine Polypeptidsequenz mit einer definierten Anzahl von reaktiven Seitenketten für die chemische Konjugation eines Toxins enthält, wurden PAS-abgeleitete Sequenzen in E. coli exprimiert und mit dem in der Zellkultur produzierten Antikörper unter Verwendung der Sortase A (SrtA) vermittelten Konjugation ortsspezifisch verknüpft. Das Konjugationsprodukt zeigte ähnliche Bindungseigenschaften wie der Wildtyp-Antikörper. Die chemische Modifikation von PAS-basierten Polypeptiden sowie deren Reinigung und Analyse bleiben jedoch eine Herausforderung, so dass deren Optimierung für weitere Anwendungen unerlässlich ist.