Monoklonale Antikörper (mAbs) haben sich über die letzten Jahre als eine der erfolgreichsten und am häufigsten verwendeten Biotherapeutika erwiesen. Für die Entdeckung von Antikörpern sind derzeit zwei Ansätze vorherrschend: Die Immunisierung von Tieren und Oberflächendisplay-Techniken, wie beispielsweise das Hefe-Display. Die erste Untersuchung im Rahmen der hier vorliegenden kumulativen Dissertation konzentrierte sich auf die Optimierung des Präsentationsnachweises beim Hefe-Display durch Umgehen der zeitaufwändigen Färbung von Protein-Anhängseln. Dies ist im konventionellen Hefe-Display nötig zur Verifizierung der Präsentation von Antikörperfragmenten in voller Länge ohne Insertionen oder vorzeitige Stoppcodons. Aus diesem Grund wurde eine ribosomale Überspringsequenz, die die Translation von zwei separaten Proteinen aus einem offenen Leserahmen ermöglicht, genetisch zwischen dem zu präsentierenden Antikörperfragment und einem grün fluoreszierenden Protein (GFP) als Reporterprotein eingebaut. Die Translation des zu präsentierenden Antikörperfragments und der ribosomalen Überspringsequenz (als 2A-Peptid bezeichnet) führt zur Freisetzung des N-terminal lokalisierten Antikörperfragments aus der Polypeptidkette und der Translokation auf die Zelloberfläche. Der 2A-Peptid-vermittelte ribosomale Sprung löst die Translation der GFP-kodierenden mRNA erneut aus. Folglich zeigen nur Hefezellen, die GFP-Fluoreszenz zeigen, das jeweilige Antikörperfragment in voller Länge. Die Kombination dieses Systems mit der von Haien abgeleiteten halbsynthetischen vNAR-Bibliothek erwies sich als ebenso effizientes Vorgehen wie das herkömmliche Verfahren mit den Vorteilen, dabei kostengünstiger und weniger zeitaufwändig zu sein. In der zweiten Untersuchung wurde die Anwendbarkeit des Hefedisplays in Kombination mit Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) zur Isolierung hochaffiner und spezifischer Antikörper nach einer Immunisierungskampagne von Hühnern untersucht. Zu diesem Zweck wurden rekombinante Antikörperbibliotheken aus der mRNA der Milz von Hühnern, die mit dem epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) und humanem Choriongonadotropin (hCG) immunisiert wurden, als single chain variable fragments (scFv) durch Overlap Extension PCR konstruiert. Eine Vielzahl von Antigen-bindenden scFvs wurde in einem geeigneten Screening- Verfahren isoliert. Die Herstellung zielspezifischer Varianten als lösliche scFv-Fc-Moleküle ermöglichte die anschließende umfassende Charakterisierung durch Bestätigung der hohen Affinität, guten Spezifität, Thermostabilität und vielversprechender Aggregationsprofile. Darüber hinaus konnte die biotechnologische Anwendbarkeit von gegen beide Antigene gerichteten Bindemolekülen demonstriert werden. Für EGFR-Binder könnte dies durch spezifische zelluläre Bindung und für hCG-Binder im Rahmen eines Lateral-Flow-Tests erreicht werden, in dem hCG-bindende scFvs als Fänger-Antikörper für den Schwangerschaftsnachweis verwendet wurden. Zusammenfassend stellte die Strategie der Verwendung von Hefe-Display ein wirksames Instrument dar, mit dem das Repertoire an Displaymethoden für die Isolierung von Antikörpern nach Hühnerimmunisierungskampagnen erweitert werden konnte. Die dritte Untersuchung konzentrierte sich auf die Entwicklung der effektiveren Erstellung von über Hefe-Display präsentierten Fab Fragment Bibliotheken. Die konservative Methode für die Fab-Bibliotheksgenerierung beruht auf der Verwendung eines dreistufigen Protokolls, das einzelne Subbibliotheken der schweren und leichten Kette umfasst, die in haploiden Hefestämmen erzeugt werden, gefolgt von einer zufälligen Kettenkombination durch Anwendung von Hefepaarung. Die hier neu entwickelte Strategie basiert auf einem Golden Gate-Klonierungsansatz, der dazu führt, dass Diversitäten sowohl der schweren als auch der leichten Kette auf einem einzigen Plasmid unter Verwendung eines bidirektionalen Promotors effizient kombiniert werden. Die Anwendbarkeit dieses Systems konnte durch zwei erfolgreiche Einzelkampagnen bestätigt werden. Die erste Untersuchung ermöglichte die Isolierung hochaffiner humaner Antikörper aus immunisierten transgenen Ratten. Darüber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass das Verfahren auch verwendet werden kann, um chimäre Huhn / Human-Antikörper nach der Immunisierung von Hühnern erfolgreich zu durchmustern und zu isolieren. Am Ende konnte gezeigt werden, dass das auf einem Golden Gate- Verfahren basierende Ein-Schritt-Verfahren die Erstellung von Bibliotheken und die Isolierung von Antikörpern aus schweren und leichten Ketten mit vergleichbarer Qualität der konventionellen Methode ermöglicht, während es wesentlich weniger Zeitaufwand erfordert und weniger komplex ist. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die potenzielle Verwendung von Einzelketten-Antikörpern aus Haien (vNARs) für die spezifische Targetierung von Lymphomzellen untersucht. In früheren Studien konnte gezeigt werden, dass eine vom Hai stammende halbsynthetische Hefebibliothek sehr gut geeignet ist, Anti-Idiotyp-Binder zu isolieren, die ausschließlich das Paratop von mABs erkennen. Lymphomzellen könnten ein attraktives Ziel für anti-idiotypische vNAR-Moleküle sein, da B-Zell- Lymphomzellen tumorspezifische und funktionell aktive B-Zell-Rezeptoren (BCR) aufweisen. Die Targetierung von BCRs für die Lymphomtherapie hat sich jedoch als anspruchsvoll erwiesen, da sich die BCRs von Patient zu Patient unterscheiden. Aus diesem Grund wurde in der vorgestellten Studie die schnelle und bequeme Isolierung spezifischer BCR-bindender vNARs aus der halbsynthetischen Bibliothek untersucht. Zu diesem Zweck wurden die BCRs der drei verschiedenen Lymphomzelllinien Daudi, SUP-B8 und IM-9 identifiziert. Anschließend wurden die variablen Domänen reformatiert und die resultierenden BCRs als monoklonale Antikörper exprimiert. Der SUP-B8-BCR wurde im Anschluss als Antigen in einer FACS-basierten Durchmusterung der auf Hefe präsentierten vNAR-Bibliotheken verwendet, was in einer Anreicherung mehrerer antigenbindender vNARs resultierte. Die weitere Charakterisierung der isolierten vNARs nach der Reformatierung als Fc-Fusionsproteine bestätigte eine affine und spezifische Bindung sowohl an die löslich rekombinant exprimierten BCR-Moleküle als auch an die originale Lymphomzelllinie. Anfängliche Experimente zur Ausnutzung der spezifischen BCRBindung für das BCR-Clustering, gefolgt von der Induktion der Zellapoptose, zeigten keinen signifikanten Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen. Ein alternativer Ansatz, der die Erzeugung multivalenter vNAR-Konstrukte oder die Konstruktion von vNAR-Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten einschließt, könnte jedoch in Zukunft eine vNAR-induzierte Abtötung von patientenspezifischen Lymphomzellen ermöglichen.