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Das Dispaseautolyse-induzierende Protein von Streptomyces mobaraensis. Struktur, Katalysemechanismus und Glutaminbindestellen für die Modifikation durch mikrobielle Transglutaminase.

Fiebig, David Alexander :
Das Dispaseautolyse-induzierende Protein von Streptomyces mobaraensis. Struktur, Katalysemechanismus und Glutaminbindestellen für die Modifikation durch mikrobielle Transglutaminase.
[Online-Edition: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/8150]
Technische Universität , Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2019)

Official URL: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/8150

Abstract

Die Transglutaminase aus Streptomyces mobaraensis (Sm-TG) ist ein wichtiges Enzym für die Vernetzung und Modifikation von Proteinen und gewann dadurch in den letzten Jahren vor allem im Bereich der zielgerichteten Konjugation an Bedeutung. Das Dispaseautolyse-induzierende Protein DAIP stellt das erste physiologische Substrat von Sm-TG dar. Gegenstand der vorliegenden Arbeit war unter anderem die Aufklärung der Tertiärstruktur sowie die Charakterisierung des DAIP hinsichtlich seiner Glutamin-Substrateigenschaften für Sm-TG. Die Primärstruktur von DAIP enthält insgesamt 5 potentielle Glutamine und 10 Lysine für die Sm-TG-vermittelte Transferasereaktion. Für die Untersuchung wurde zunächst ein Produktionsverfahren zur Herstellung von rekombinantem DAIP in E. coli entwickelt. Die Produktion von glutamindefizienten DAIP-Varianten erfolgte jeweils durch Austausch von vier der insgesamt fünf vorhandenen Glutamine gegen Asparagin über ortsgerichtete Mutagenese. Die enzymvermittelte Konjugation von Monobiotinylcadaverin zeigte eine Präferenz von Sm-TG für die DAIP-Glutamine in der Reihenfolge Gln39 >> Gln298 > Gln345 ~ Gln65 >> Gln144. Es konnte gezeigt werden, dass die Spezifität und Effizienz von Sm-TG primär von der Flexibilität des Substratglutamins (Loop >> β-Faltblatt) und von der Aminosäurezusammensetzung der direkten molekularen Umgebung (klein unpolar >> voluminös > geladen) beeinflusst wird. Aufgrund fehlender Homologie zu den bisher größtenteils über Peptide abgeleiteten Sm-TG-Glutamin-Konsensussequenzen lieferte DAIP vor allem interessante Einblicke in die übergeordneten strukturellen Voraussetzungen des enzymatischen Umsatzes von Substratproteinen. In der Struktur des seven-bladed β-propeller DAIP befinden sich die präferierten Glutamine gemeinsam gruppiert auf der Oberseite des trapezförmigen Proteins und legt damit eine zielgerichtete Vernetzung von DAIP nach Selbstassemblierung in der bakteriellen Zellwand durch Sm-TG nahe. Auf Grundlage der biochemischen und strukturellen Daten des ersten physiologischen Sm-TG-Substrats konnten so neue Einblicke in die Determinanten der enzymvermittelten Modifikation, Spezifität und Effizienz gewonnen werden. DAIP besitzt über die Sm-TG-Substrateigenschaften hinaus die bisher noch nicht beschriebene Fähigkeit zur Inaktivierung neutraler Metalloproteasen durch Eigenhydrolyse. Das Fehlen einer katalytischen Domäne führte zu der Annahme, dass DAIP durch strukturelle Modifikation der Metalloprotease die Autolysebereitschaft erhöht. Der Nachweis und die Isolation von Proteinkomplexen bestehend aus DAIP und Thermolysin, Pseudolysin oder nicht-funktionellem rBacillolysin-E138A unterstützten diese Annahme vor allem aufgrund der hohen Affinität der Bindung. Der Einfluss auf die Konformation ließ sich dabei auch über die DAIP-vermittelte Inhibierung von Thermolysin und Pseudolysin nachweisen, wohingegen Bacillolysin und Aureolysin direkt autolysierten. Eine ähnlich schnelle Hydrolyse von Thermolysin konnte erst nach Zugabe amphiphiler Moleküle beobachtet werden, welche potentiell die induzierten strukturellen Modifikationen verstärkten. Interessanterweise erlaubte der Farbstoff SYPRO-Orange die Verfolgung des schnellen Autolyse/Hydrolyse-Prozesses, welcher zu Beginn durch einen steilen Anstieg der Fluoreszenz gekennzeichnet war. DAIP vermittelte weiterhin den proteolytischen Abbau von rBacillolysin-E138A-FITC durch Trypsin, was sich durch eine lineare Abnahme der Fluoreszenzpolarisation ausdrückte. Mithilfe dieser Daten war es möglich, ein kinetisches Modell des DAIP-Mechanismus zu erstellen, welches (I) die DAIP-Protease-Komplexbildung, (II) die strukturelle Modifikation der Protease und letztlich (III) die Hydrolyse umfasst. Dieser Prozess konnte zudem durch Kristallisation von DAIP mit Thermolysin bestätigt werden. Die strukturelle Überlagerung des Komplexes mit Thermolysin implizierte eine konformationelle Veränderung bei der Bindung an DAIP. Die daraus abgeleiteten DAIP-Varianten zeigten, dass Komplexbildung, Proteaseinhibierung und Transformation in einen autolysesensitiven Zustand nicht zwangsweise miteinander verknüpft sind und ermöglichten die Identifikation der an der Modifikation beteiligten Aminosäuren. Die identifizierten Zielproteasen des DAIP, darunter bekannte Pathogenitätsfaktoren von Bakterien, eröffnen neue Ansätze in der Bekämpfung von Infektionskrankheiten. Das in dieser Arbeit entwickelte Verständnis, wie DAIP Metalloproteasen inaktiviert, liefert dazu einen substantiellen Beitrag.

Item Type: Ph.D. Thesis
Erschienen: 2019
Creators: Fiebig, David Alexander
Title: Das Dispaseautolyse-induzierende Protein von Streptomyces mobaraensis. Struktur, Katalysemechanismus und Glutaminbindestellen für die Modifikation durch mikrobielle Transglutaminase.
Language: German
Abstract:

Die Transglutaminase aus Streptomyces mobaraensis (Sm-TG) ist ein wichtiges Enzym für die Vernetzung und Modifikation von Proteinen und gewann dadurch in den letzten Jahren vor allem im Bereich der zielgerichteten Konjugation an Bedeutung. Das Dispaseautolyse-induzierende Protein DAIP stellt das erste physiologische Substrat von Sm-TG dar. Gegenstand der vorliegenden Arbeit war unter anderem die Aufklärung der Tertiärstruktur sowie die Charakterisierung des DAIP hinsichtlich seiner Glutamin-Substrateigenschaften für Sm-TG. Die Primärstruktur von DAIP enthält insgesamt 5 potentielle Glutamine und 10 Lysine für die Sm-TG-vermittelte Transferasereaktion. Für die Untersuchung wurde zunächst ein Produktionsverfahren zur Herstellung von rekombinantem DAIP in E. coli entwickelt. Die Produktion von glutamindefizienten DAIP-Varianten erfolgte jeweils durch Austausch von vier der insgesamt fünf vorhandenen Glutamine gegen Asparagin über ortsgerichtete Mutagenese. Die enzymvermittelte Konjugation von Monobiotinylcadaverin zeigte eine Präferenz von Sm-TG für die DAIP-Glutamine in der Reihenfolge Gln39 >> Gln298 > Gln345 ~ Gln65 >> Gln144. Es konnte gezeigt werden, dass die Spezifität und Effizienz von Sm-TG primär von der Flexibilität des Substratglutamins (Loop >> β-Faltblatt) und von der Aminosäurezusammensetzung der direkten molekularen Umgebung (klein unpolar >> voluminös > geladen) beeinflusst wird. Aufgrund fehlender Homologie zu den bisher größtenteils über Peptide abgeleiteten Sm-TG-Glutamin-Konsensussequenzen lieferte DAIP vor allem interessante Einblicke in die übergeordneten strukturellen Voraussetzungen des enzymatischen Umsatzes von Substratproteinen. In der Struktur des seven-bladed β-propeller DAIP befinden sich die präferierten Glutamine gemeinsam gruppiert auf der Oberseite des trapezförmigen Proteins und legt damit eine zielgerichtete Vernetzung von DAIP nach Selbstassemblierung in der bakteriellen Zellwand durch Sm-TG nahe. Auf Grundlage der biochemischen und strukturellen Daten des ersten physiologischen Sm-TG-Substrats konnten so neue Einblicke in die Determinanten der enzymvermittelten Modifikation, Spezifität und Effizienz gewonnen werden. DAIP besitzt über die Sm-TG-Substrateigenschaften hinaus die bisher noch nicht beschriebene Fähigkeit zur Inaktivierung neutraler Metalloproteasen durch Eigenhydrolyse. Das Fehlen einer katalytischen Domäne führte zu der Annahme, dass DAIP durch strukturelle Modifikation der Metalloprotease die Autolysebereitschaft erhöht. Der Nachweis und die Isolation von Proteinkomplexen bestehend aus DAIP und Thermolysin, Pseudolysin oder nicht-funktionellem rBacillolysin-E138A unterstützten diese Annahme vor allem aufgrund der hohen Affinität der Bindung. Der Einfluss auf die Konformation ließ sich dabei auch über die DAIP-vermittelte Inhibierung von Thermolysin und Pseudolysin nachweisen, wohingegen Bacillolysin und Aureolysin direkt autolysierten. Eine ähnlich schnelle Hydrolyse von Thermolysin konnte erst nach Zugabe amphiphiler Moleküle beobachtet werden, welche potentiell die induzierten strukturellen Modifikationen verstärkten. Interessanterweise erlaubte der Farbstoff SYPRO-Orange die Verfolgung des schnellen Autolyse/Hydrolyse-Prozesses, welcher zu Beginn durch einen steilen Anstieg der Fluoreszenz gekennzeichnet war. DAIP vermittelte weiterhin den proteolytischen Abbau von rBacillolysin-E138A-FITC durch Trypsin, was sich durch eine lineare Abnahme der Fluoreszenzpolarisation ausdrückte. Mithilfe dieser Daten war es möglich, ein kinetisches Modell des DAIP-Mechanismus zu erstellen, welches (I) die DAIP-Protease-Komplexbildung, (II) die strukturelle Modifikation der Protease und letztlich (III) die Hydrolyse umfasst. Dieser Prozess konnte zudem durch Kristallisation von DAIP mit Thermolysin bestätigt werden. Die strukturelle Überlagerung des Komplexes mit Thermolysin implizierte eine konformationelle Veränderung bei der Bindung an DAIP. Die daraus abgeleiteten DAIP-Varianten zeigten, dass Komplexbildung, Proteaseinhibierung und Transformation in einen autolysesensitiven Zustand nicht zwangsweise miteinander verknüpft sind und ermöglichten die Identifikation der an der Modifikation beteiligten Aminosäuren. Die identifizierten Zielproteasen des DAIP, darunter bekannte Pathogenitätsfaktoren von Bakterien, eröffnen neue Ansätze in der Bekämpfung von Infektionskrankheiten. Das in dieser Arbeit entwickelte Verständnis, wie DAIP Metalloproteasen inaktiviert, liefert dazu einen substantiellen Beitrag.

Place of Publication: Darmstadt
Divisions: 07 Fachbereich Chemie
07 Fachbereich Chemie > Fachgebiet Biochemie
07 Fachbereich Chemie > Fachgebiet Biochemie > Allgemeine Biochemie
Date Deposited: 10 Mar 2019 20:55
Official URL: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/8150
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-81504
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald and Fuchsbauer, Prof. Dr. Hans-Lothar
Refereed / Verteidigung / mdl. Prüfung: 11 February 2019
Alternative Abstract:
Alternative abstract Language
Transglutaminase from Streptomyces mobaraensis (Sm-TG) is an important enzyme for the modification of proteins by cross-linkage and therefore gained in importance especially in terms of site-directed conjugation. The Dispase autolysis-inducing protein DAIP is the first described natural substrate of Sm-TG. Main aspects of this thesis were the structure determination of DAIP and characterization of its glutamine-substrate properties for Sm-TG. The primary structure of DAIP contains 5 potential glutamine and 10 lysine residues for Sm-TG-mediated transferase reaction. Initially, a production and purification procedure for the recombinant expression of DAIP fused to a CPD domain in E. coli was developed. Production of glutamine-deficient variants was accomplished by substitution of four out of the overall five glutamine residues with asparagine via site-directed mutagenesis. Sm-TG-mediated conjugation of biotin cadaverin showed preference for the DAIP-glutamines in the order of Gln39 >> Gln298 > Gln345 ~ Gln65 >> Gln144. It could be shown that specificity and efficiency of Sm-TG was mainly driven by glutamine flexibility (loop >> β-sheet) and amino acid composition in close molecular vicinity (small apolar >> voluminous > charged). Due to lacking similarity to other Sm-TG glutamine consensus sequences mainly derived by peptides, DAIP allows interesting insights into superior structural prerequisites for enzymatic turnover of substrate proteins. The preferred glutamine residues for transamidation cluster at the top side of the trapeze-shaped seven-bladed beta propeller DAIP and therefore imply site-directed DAIP-crosslinking into the bacterial cell wall by Sm-TG after self-assembly. Based on the biochemical and structural data of the first described physiological Sm-TG substrate, new insights into the determinants of enzyme-mediated modification, specificity and efficiency were gained. Beside its Sm-TG substrate properties, DAIP possesses the ability to inactivate neutral metalloproteases by inducing self-degradation that has not been described yet. Absence of a catalytic domain led to the assumption that DAIP elevates the disposition to autolysis of the metalloprotease by structural modifications. Detection and isolation of protein complexes composed of DAIP and thermolysin, pseudolysin or non-functional rbacillolysin-E138A supported this hypothesis especially due to high affinity binding. The impact on conformation was also demonstrated by DAIP-mediated inhibition of thermolysin and pseudolysin, whereas bacillolysin and aureolysin directly went into autolysis. For thermolysin, similar results could only be obtained after addition of amphiphile compounds that presumably enhance the structural modifications induced by DAIP. Interestingly, the merocyanin dye SYPRO-Orange allowed online monitoring of the rapid autolysis/hydrolysis, which was characterized by an initial steep increase in fluorescence intensity followed by a protease dependent decrease. Furthermore, DAIP induced proteolytic degradation of rbacillolysin-E138A-FITC by trypsin, which was demonstrated by linear decrease in fluorescence polarization. Based on these data a kinetic model of the DAIP mechanism was developed that comprises (I) DAIP-protease complex formation, (II) structural modification of the target protease and (III) final hydrolysis. This mechanism was substantiated by crystallization of DAIP and thermolysin. Structural superposition of the complex with native thermolysin implicated conformational changes on DAIP-binding. DAIP variants derived by the complex structure furthermore revealed that complex formation, protease inhibition and transformation into an autolysis-prone state do not determine each other. These variants also allowed the identification of the amino acids involved in structural modification of the target enzyme. The identified target proteases, including several bacterial virulence factors, and the understanding how DAIP inactivates metalloproteases may offer opportunities for pharmaceutical applications.English
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