Fiebig, David Alexander (2019)
Das Dispaseautolyse-induzierende Protein von Streptomyces mobaraensis. Struktur, Katalysemechanismus und Glutaminbindestellen für die Modifikation durch mikrobielle Transglutaminase.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

Die Transglutaminase aus Streptomyces mobaraensis (Sm-TG) ist ein wichtiges Enzym für die Vernetzung und Modifikation von Proteinen und gewann dadurch in den letzten Jahren vor allem im Bereich der zielgerichteten Konjugation an Bedeutung. Das Dispaseautolyse-induzierende Protein DAIP stellt das erste physiologische Substrat von Sm-TG dar. Gegenstand der vorliegenden Arbeit war unter anderem die Aufklärung der Tertiärstruktur sowie die Charakterisierung des DAIP hinsichtlich seiner Glutamin-Substrateigenschaften für Sm-TG. Die Primärstruktur von DAIP enthält insgesamt 5 potentielle Glutamine und 10 Lysine für die Sm-TG-vermittelte Transferasereaktion. Für die Untersuchung wurde zunächst ein Produktionsverfahren zur Herstellung von rekombinantem DAIP in E. coli entwickelt. Die Produktion von glutamindefizienten DAIP-Varianten erfolgte jeweils durch Austausch von vier der insgesamt fünf vorhandenen Glutamine gegen Asparagin über ortsgerichtete Mutagenese. Die enzymvermittelte Konjugation von Monobiotinylcadaverin zeigte eine Präferenz von Sm-TG für die DAIP-Glutamine in der Reihenfolge Gln39 >> Gln298 > Gln345 ~ Gln65 >> Gln144. Es konnte gezeigt werden, dass die Spezifität und Effizienz von Sm-TG primär von der Flexibilität des Substratglutamins (Loop >> β-Faltblatt) und von der Aminosäurezusammensetzung der direkten molekularen Umgebung (klein unpolar >> voluminös > geladen) beeinflusst wird. Aufgrund fehlender Homologie zu den bisher größtenteils über Peptide abgeleiteten Sm-TG-Glutamin-Konsensussequenzen lieferte DAIP vor allem interessante Einblicke in die übergeordneten strukturellen Voraussetzungen des enzymatischen Umsatzes von Substratproteinen. In der Struktur des seven-bladed β-propeller DAIP befinden sich die präferierten Glutamine gemeinsam gruppiert auf der Oberseite des trapezförmigen Proteins und legt damit eine zielgerichtete Vernetzung von DAIP nach Selbstassemblierung in der bakteriellen Zellwand durch Sm-TG nahe. Auf Grundlage der biochemischen und strukturellen Daten des ersten physiologischen Sm-TG-Substrats konnten so neue Einblicke in die Determinanten der enzymvermittelten Modifikation, Spezifität und Effizienz gewonnen werden. DAIP besitzt über die Sm-TG-Substrateigenschaften hinaus die bisher noch nicht beschriebene Fähigkeit zur Inaktivierung neutraler Metalloproteasen durch Eigenhydrolyse. Das Fehlen einer katalytischen Domäne führte zu der Annahme, dass DAIP durch strukturelle Modifikation der Metalloprotease die Autolysebereitschaft erhöht. Der Nachweis und die Isolation von Proteinkomplexen bestehend aus DAIP und Thermolysin, Pseudolysin oder nicht-funktionellem rBacillolysin-E138A unterstützten diese Annahme vor allem aufgrund der hohen Affinität der Bindung. Der Einfluss auf die Konformation ließ sich dabei auch über die DAIP-vermittelte Inhibierung von Thermolysin und Pseudolysin nachweisen, wohingegen Bacillolysin und Aureolysin direkt autolysierten. Eine ähnlich schnelle Hydrolyse von Thermolysin konnte erst nach Zugabe amphiphiler Moleküle beobachtet werden, welche potentiell die induzierten strukturellen Modifikationen verstärkten. Interessanterweise erlaubte der Farbstoff SYPRO-Orange die Verfolgung des schnellen Autolyse/Hydrolyse-Prozesses, welcher zu Beginn durch einen steilen Anstieg der Fluoreszenz gekennzeichnet war. DAIP vermittelte weiterhin den proteolytischen Abbau von rBacillolysin-E138A-FITC durch Trypsin, was sich durch eine lineare Abnahme der Fluoreszenzpolarisation ausdrückte. Mithilfe dieser Daten war es möglich, ein kinetisches Modell des DAIP-Mechanismus zu erstellen, welches (I) die DAIP-Protease-Komplexbildung, (II) die strukturelle Modifikation der Protease und letztlich (III) die Hydrolyse umfasst. Dieser Prozess konnte zudem durch Kristallisation von DAIP mit Thermolysin bestätigt werden. Die strukturelle Überlagerung des Komplexes mit Thermolysin implizierte eine konformationelle Veränderung bei der Bindung an DAIP. Die daraus abgeleiteten DAIP-Varianten zeigten, dass Komplexbildung, Proteaseinhibierung und Transformation in einen autolysesensitiven Zustand nicht zwangsweise miteinander verknüpft sind und ermöglichten die Identifikation der an der Modifikation beteiligten Aminosäuren. Die identifizierten Zielproteasen des DAIP, darunter bekannte Pathogenitätsfaktoren von Bakterien, eröffnen neue Ansätze in der Bekämpfung von Infektionskrankheiten. Das in dieser Arbeit entwickelte Verständnis, wie DAIP Metalloproteasen inaktiviert, liefert dazu einen substantiellen Beitrag.

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