Mikrofluidische Chips eignen sich hervorragend für Einzelzellmessungen. Spezielle De- signs ermöglichen das Separieren und Einfangen von einzelnen Saccharomyces cere- visiae. Das Mikroskop als leistungsstarkes Instrument zur Bestimmung von temporalen und spartialen Abläufen gewährleistet die Aufnahme von relevanten Informationen. Meine Arbeit wird durch zwei Themen motiviert. Zum einen wird ein mikrofluidischer Chip weiterentwickelt, welcher einzelne Zellen einfängt um langandauernde Experimente unter gleichbleibenden Bedingungen zu erlauben. Zum anderen wird untersucht, wie sich die Transkriptionsdynamik unter Induktion verändert. Zunächst zum Chip: Die erste Verbesserung betrifft eine wesentliche Verkleinerung des Layouts. Nun finden bis zu fünf Zellobservationskammern auf einem Chip Platz. Zudem wird die Herstellung erleichtert indem zwei von vier Masken zu einer zusammen- gelegt werden. Drei verschiedene Layouts werden entworfen, um entsprechende Experi- mente durchführen zu können. Das erste Design bietet Platz für vier unterschiedliche Hefestämme, die in einem Experiment verglichen werden sollen. Das zweite hat vier eng aneinanderliegende Zellkammern in denen unabhängige Messungen in einem Lauf aufgenommen werden können. Das letzte Design erhöht vornehmlich die Wiederverwert- barkeit eines Chips mit fünf Kammern. Die zweite Optimierung steigert nicht nur die Produktionsrate, sondern testet auch an- dere Formen der Zellfallen. Die Platznutung wird weiter verbessert und die Chips bieten nun zwischen sieben und zwöf Kammern. Da die Herstellung mit den bisherigen Fallen an ihre Grenze stößt, werden neben bereits publizierten Fallen auch ovale Formen mit erhöhter Fläche entworfen und getestet. Hierbei zeigt sich, dass nur die größten Fallen mit gleichbleibender Qualität hergestellt werden können. Erst mit der Verwendung eines Laser-Direkt-Writers kann die Fabrikation mit allen Formen vollendet werden. Die aus der Literatur bekannten L-förmigen Fallen weisen die beste Fangrate (90%) auf. Kleinere Fallen haben geringere Abstände und kommen trotz 70%iger Fangrate auf die gleiche Anzahl an aufgenommenen Zellen. Die Kooperation mit Dr. Christopher Schneider (AG Süß) kann auf den Chip mit vier unabhängigen Kammern zurückgreifen. Als genetischer Schalter wird ein Aptamer kon- struiert, welcher sowohl auf Neomycin als auch auf Tetrazyklin die Translation inhibiert (yCS). In den vier Kammern können daher zeitgleich die Positiv-Kontrolle, Neomycin, Tetrazyklin und die Kombination beider aufgenommen und ausgewertet werden. Dies gewährt eine Zeitersparnis von rund drei Tagen gegenüber der Verwendung des ur- sprünglichen Chips. Der genetische Schalter zeigt Wirkung: Neo und Tc reprimieren beide die Produktion von GFP 70 Minuten nach Zugabe. Der Chip mit vier parallelen Zellkammern kommt in der Kooperation mit Sebstian Höler (AG Thiel) zum Einsatz. Hierbei wird die Genexpression eines Licht-abhängigen Kaliumkanals untersucht (ySH). Mehrere verschiedene Sequenzoptimierungen werden vergleichend aufgenommen. Dabei stellt sich heraus, dass die einfache Sequenz das beste Signal liefert. Der Kaliumkanal lagert sich in allen Varianten im endoplasmatischen Retikulum ein. Der zweite Forschungsschwerpunkt meiner Dissertation dreht sich um die Transkrip- tionsdynamik. Auch hier werden einzelne Zellen unter dem Mikroskop mit dem mikroflu- idischen Chip gemessen. Die Visualisierung der Transkription in Echtzeit wird mittels dem Coat-Proteins des Phagen PP7 realisiert. Eine Stammschleife in der mRNA-Sequenz wird erkannt und durch Repititionen kann eine Akkumulation von PP7-GFP herbeigeführt werden, welche als Punkt gemessen wird. 14 solcher Stammschleifen vor dem Gal10-Gen werden mit dem Transkriptionsfaktor GEV unter Zugabe von β-Estradiol synthetisiert (yJD). Da Transkription als stochastischer Prozess großen Schwankungen unterworfen ist (sog. Bursts), ist es von Interesse, wie sich Burstintensität und -frequenz durch unter- schiedlich starke Stimulation beeinflussen lassen. Der erste Fund betrifft die Anzahl an S. cerevisiae Zellen, welche auf die Stimulation reagieren. Mit der höchsten verwendeten Konzentration von 500 nM β-Estradiol hat man die höchste Fraktion an Respondern mit ca. 45% gefunden. Zudem steigt die Anzahl über die Dauer des Experimentes stetig an, was mit einer Steigerung der Re-Initiationsrate erklärt werden kann. Die hohe Konzentra- tion an vorliegendem GEV im Nukleus führt zu einer höheren Wahrscheinlichkeit aktive Zellen zu beobachten. Entgegen der Erwartung und Literaturerkenntnisse ist dies die einzige Variable, welche mit der Dosis korreliert. Die Transkriptionsdynamik als solche bleibt in diesem Assay unberührt. Exprimiert eine Zelle das Konstrukt, so folgt die pro- duzierte mRNA Menge über alle Konzentrationen der gleichen Verteilung. In einer weiterführenden Studie soll der Einfluss des GC-Gehalts des DNA-Templates auf die Elongationsgeschwindigkeit ermittelt werden. Die Klonierung eines Plasmides mit 10 Stammschleifen für PP7, 1000 Basenpaaren einer 66% GC-haltigen Sequenz und anschließend 24 Stammschleifen des MS2 Coat-Proteins ermöglichen eine genauere Analyse der Elongationsrate durch die Aufnahme in zwei Farbkanälen. Dabei sollte zuerst PP7-GFP an die mRNA binden und den Begin des GC-haltigen Gen markieren, während MS2-RFP gegen Ende der Transkription sich an die mRNA lagert. Die Integration dieses Konstruktes ist nicht rechtzeitig vollendet worden und keine Aufnahme mit zwei Farben kann ausgewertet werden. Ich fasse die Kernpunkte meiner Thesis wie folgt zusammen: Die Optimierung des Chiplayouts hat den Herstellungsprozess vereinfacht und zu einer Steigerung der pro- duzierten Chips geführt. Die getesteten Fallenstukturen sind alle funktionsfähig und können Hefen über große Zeiträume hinweg kultivieren. Der genetische Schalter yCS lässt sich mit beiden Liganden reprimieren und der Licht-induzierbare Kaliumkanal ySH zeigt die gleiche Expressionsdynamik für unterschiedliche DNA-Sequenzen. Und die induzierte Transkription am Gal10 Lokus steigert die Rate mit der Zellen aktiv werden.