Fried, Dorothee (2018)
Molekulare Analyse der Interaktion der Disintegrin-Metalloproteinase ADAM15 mit der Fokalen Adhasionskinase und dem Poly(A)-Binding Protein in osteoarthrotischen Chondrozyten.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

ADAM15 (A Disintegrin And Metalloproteinase 15) ist ein aus mehreren Domänen bestehendes Transmembranprotein. Neben den extrazellulären Pro-, Metalloproteinase-, Disintegrin-, Cystein-reichen- und EGF-ähnlichen Domänen beinhaltet es auch eine zytoplasmatische Domäne. Die erhöhte Expression von ADAM15 ist assoziiert mit aggressiven Krebsformen, wie beispielsweise Burst- und Prostatakrebs. Darüber hinaus wird eine hohe Expression von ADAM15 in nicht-neoplastischen und entzündlichen Geweben, mit denen ein Umbau der extrazellulären Matrix einhergeht, wie zum Beispiel Osteoarthrose nachgewiesen. Die Funktion von ADAM15 im osteoarthrotischen Knorpel ist allerdings nicht destruktiv sondern homöostatisch, wie ein ADAM15-defizientes Mausmodell und mit ADAM15 transfizierte chondrozytäre Zellen, die eine höheren Apoptose-Resistenz aufwiesen, darlegten. ADAM15 ist fähig durch genotoxischen Stress induzierter Apoptose durch die Suppression der Aktivierung von Caspase-3 entgegenzuwirken. Eine Zelllinie, die das Plasmamembran-gebundene ADAM15 ohne zytoplasmatische Domäne exprimierte, hatte diese anti-apoptotische Fähigkeit verloren, was eine bedeutende Rolle der intrazellulären Domäne als ein Gerüst für die Rekrutierung von Signal-übermittelnden Kinasen vermuten ließ. Zusätzlich war die Frage der direkten molekularen Interaktion der zytoplasmatischen Domäne von ADAM15 mit der Fokalen Adhäsionskinase (FAK), basierend auf dem bereits publizierten modulierenden Einfluss von ADAM15 auf die FAK-Signalwege, offen. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte die spezifische Bindung der Linker-Region zwischen der Kinase- und FAT-Domäne der FAK an die zytoplasmatische Domäne von ADAM15 eindeutig mittels Mammalian Two-Hybrid-, Pulldown- und Dot Blot-Versuchen bewiesen werden. Desweiteren wurde eine erhöhte Phosphorylierung der FAK an den Tyrosinresten Y397, Y576 und Y861 nach der Induktion von genotoxischem Stress mittels Camptothecin in ADAM15-transfizierten T/C28a4 Chondrozyten detektiert. Die Hypothese, dass die zytoplasmatische Domäne von ADAM15 ein sensiertes extrazelluläres Signal übermitteln kann und daraus folgend zu einer Erhöhung der FAK-Phosphorylierung führt, wurde mittels der IL-2-Stimulation von Zellen, die mit einem chimären Konstrukt bestehend aus der extrazellulären IL-2 Rezeptor-Untereinheit α und der zytoplasmatischen Domäne von ADAM15 transfiziert waren, bestätigt. Als Folge der ADAM15-abhängigen FAK-Phosphorylierung kommt es zur Bildung eines aktivierten FAK-Src-Komplexes, der zur Aktivierung von Überlebens-Signalwegen führt. Die neu entdeckte gegen-regulatorische Antwort auf genotoxischen Stress ist nicht nur im chondrozytären Überlebens-Signalweg sondern auch potentiell für die Apoptose-Resistenz im neoplastischen Wachstum relevant. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Bindung der Poly(A)-Binding Proteins (PABP) an ADAM15 analysiert. Auf Grund der potentiellen Funktionen der zytoplasmatischen Domäne von ADAM15 bei pathophysiologischen Vorgängen, wie sie bei verschiedenen Splice-Varianten von ADAM15, die zu unterschiedlich metastatischem Zellverhalten führen, beobachtet werden, wurden weitere Interaktionspartner mittels MALDI-TOF gesucht. Dadurch wurde PABP als Bindungspartner identifiziert und in Ko-Immunpräzipitationsversuchen bestätigt. Mittels ELISA- und Mammalian Two-Hybrid-Versuchen wurde die spezifische Bindung der Prolin-reichen Linker Region zwischen RRM4 (RNA Recognition Motive 4) und C-terminaler PABC-Domäne von PABP an die zytoplasmatische Domäne von ADAM15 bewiesen. Die Ko-Lokalisation von ADAM15 und PABP an der Plasmamembran in OA-Chondrozyten und K4IM-Synovialfibroblasten konnte allerdings nur während der Re-Adhäsion der Zellen beobachtet werden. Mittels des etablierten Re-Adhäsions-Assays ließ sich die von der zytoplasmatischen Domäne von ADAM15 abhängige, temporäre Lokalisation von PABP an der Plasmamembran in ADAM15-transfizierten T/C28a4-Chondrozyten nachweisen. Da PABP als RNA-bindendes Protein an der Translationsregulation beteiligt ist, wurde die Translation an der Plasmamembran unter Verwendung von Puromycin und anti-Puromycin Antikörpern untersucht. Sowohl mit ADAM15 als auch mit PABP wurde die Translation in re-adhärierten OA-Chondrozyten und K4IM-Synovial¬fibroblasten ko-lokal an der Plasmamembran detektiert. Weiterhin konnte die Abhängigkeit von ADAM15 dieser Translations-Lokalisation in ADAM15-transfizierten T/C28a4-Chondrozyten und ADAM15-herab-regulierten HeLa-Zellen bewiesen werden. Die subzelluläre Lokalisation von PABP und folglich der Translation könnte durch einen Verankerungsmechanismus an der Plasmamembran mittels ADAM15 hervorgerufen werden, resultierend in einer Bildung von Membranfortsätzen (Lamellipodien), die zur Adhäsion oder Migration der Zelle führen. Die Fähigkeit einer Zelle Lamellipodien zu bilden ist ein wichtiger Schritt der Metastasierungskaskade, auf welche die Expression von ADAM15 einen Einfluss haben könnte.

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