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TetR-binding aptamer as a versatile regulatory element

Mol, Adam Artur (2020):
TetR-binding aptamer as a versatile regulatory element. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität,
DOI: 10.25534/tuprints-00011845,
[Ph.D. Thesis]

Abstract

Synthetic biology explores the means of redesign and fabrication of existing biological systems or the de novo design and generation of biological components that are entirely new to nature. The main focus of the relatively new and dynamic discipline is to develop programmable genetic regulatory systems. Precise, reversible and temporary control of gene expression as well as in-depth understanding of fundamental genetics are crucial for the programming of new genetic circuits. RNA represents one of the most powerful substrates in the engineering of biological systems, as it is versatile, designable and easily characterizable. Among the diverse functions of RNA molecules, their role as natural riboswitches has predominantly inspired researchers to design synthetic RNA-based regulators. Most of RNA devices contain a sensor element, an aptamer domain, which recognizes small molecules or protein ligands with high specificity and affinity, and an expression platform, controlling gene expression via various mechanisms. Generally, binding of a specific ligand to the aptamer domain stabilizes the RNA molecule or causes conformational changes in its structure; these further regulate transcription, translation and mRNA processing and degradation. Engineered RNA-based devices have already demonstrated multiple applications in synthetic biology. However, their implementation was mostly validated in bacteria and yeast, while mammalian synthetic biology has lagged behind. Splicing of pre-mRNAs is an essential process in human cells that generates a diverse proteome through networks of coordinated splicing events and offers an additional layer of control for synthetic RNA devices. The reprogrammed removal of intronic sequences could provide a novel approach for the development of gene therapies to tackle disease phenotypes. For this purpose, it is necessary to design tools that allow precise and timely control of the splicing mechanisms. In the first research project described in the presented doctoral thesis, a versatile and highly efficient splicing device enabling control of gene expression in human cells and making use of an RNA aptamer recognized by the TetR was designed. Further, the portability of the splicing device was shown through its functionality in various reporter systems and the endogenous gene context. In the course of the thesis, the first inducible model for alternative 3’ splice site recognition with the tetracycline repressor (TetR) aptamer leading to production of splice variants with different subcellular localization was generated. The applicability of the system was corroborated in experiments aimed at controlling nuclear import in human cells. The proposed approach may prove valuable in phenotypic studies of essential genes and provide an alternative in the development of therapeutic strategies, as the nucleo-cytoplasmic transport is vital for the maintenance of balanced cell physiology, with aberrant spatiotemporal localization of proteins leading to the development of various disorders and cancer. Finally, the third research project undertaken in the course of my doctoral studies focused on the development and optimization of the TetR aptamer dependent translational control system in human cells. Translational regulation constitutes an important point of post-transcriptional control of gene expression, enabling the cell to rapidly change the level of a specific gene product. Up to now, no efficient aptamer-ligand based translational regulatory system has been demonstrated in mammalian cells.

Item Type: Ph.D. Thesis
Erschienen: 2020
Creators: Mol, Adam Artur
Status: Publisher's Version
Title: TetR-binding aptamer as a versatile regulatory element
Language: English
Abstract:

Synthetic biology explores the means of redesign and fabrication of existing biological systems or the de novo design and generation of biological components that are entirely new to nature. The main focus of the relatively new and dynamic discipline is to develop programmable genetic regulatory systems. Precise, reversible and temporary control of gene expression as well as in-depth understanding of fundamental genetics are crucial for the programming of new genetic circuits. RNA represents one of the most powerful substrates in the engineering of biological systems, as it is versatile, designable and easily characterizable. Among the diverse functions of RNA molecules, their role as natural riboswitches has predominantly inspired researchers to design synthetic RNA-based regulators. Most of RNA devices contain a sensor element, an aptamer domain, which recognizes small molecules or protein ligands with high specificity and affinity, and an expression platform, controlling gene expression via various mechanisms. Generally, binding of a specific ligand to the aptamer domain stabilizes the RNA molecule or causes conformational changes in its structure; these further regulate transcription, translation and mRNA processing and degradation. Engineered RNA-based devices have already demonstrated multiple applications in synthetic biology. However, their implementation was mostly validated in bacteria and yeast, while mammalian synthetic biology has lagged behind. Splicing of pre-mRNAs is an essential process in human cells that generates a diverse proteome through networks of coordinated splicing events and offers an additional layer of control for synthetic RNA devices. The reprogrammed removal of intronic sequences could provide a novel approach for the development of gene therapies to tackle disease phenotypes. For this purpose, it is necessary to design tools that allow precise and timely control of the splicing mechanisms. In the first research project described in the presented doctoral thesis, a versatile and highly efficient splicing device enabling control of gene expression in human cells and making use of an RNA aptamer recognized by the TetR was designed. Further, the portability of the splicing device was shown through its functionality in various reporter systems and the endogenous gene context. In the course of the thesis, the first inducible model for alternative 3’ splice site recognition with the tetracycline repressor (TetR) aptamer leading to production of splice variants with different subcellular localization was generated. The applicability of the system was corroborated in experiments aimed at controlling nuclear import in human cells. The proposed approach may prove valuable in phenotypic studies of essential genes and provide an alternative in the development of therapeutic strategies, as the nucleo-cytoplasmic transport is vital for the maintenance of balanced cell physiology, with aberrant spatiotemporal localization of proteins leading to the development of various disorders and cancer. Finally, the third research project undertaken in the course of my doctoral studies focused on the development and optimization of the TetR aptamer dependent translational control system in human cells. Translational regulation constitutes an important point of post-transcriptional control of gene expression, enabling the cell to rapidly change the level of a specific gene product. Up to now, no efficient aptamer-ligand based translational regulatory system has been demonstrated in mammalian cells.

Place of Publication: Darmstadt
Collation: 100 Seiten
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Synthetic Genetic Circuits
Date Deposited: 08 Dec 2020 08:14
DOI: 10.25534/tuprints-00011845
Official URL: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/11845
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-118455
Referees: Süß, Prof. Dr. Beatrix ; Cardoso, Prof. Dr. M. Cristina
Refereed / Verteidigung / mdl. Prüfung: 25 June 2018
Alternative Abstract:
Alternative abstract Language

Die Synthetische Biologie erforscht die Mittel zur Neugestaltung und Herstellung bestehender biologischer Systeme oder das de novo-Design und die Erzeugung biologischer Komponenten, die in der Natur völlig neu sind. Das Hauptaugenmerk der relativ neuen und dynamischen Disziplin liegt auf der Entwicklung programmierbarer genetischer Regulationssysteme. Eine präzise, reversible und temporäre Kontrolle der Genexpression sowie ein tiefes Verständnis der grundlegenden Genetik sind für die Programmierung neuer genetischer Schaltkreise von entscheidender Bedeutung. Die RNA stellt eines der leistungsstärksten Substrate bei der Entwicklung biologischer Systeme dar, da sie vielseitig, gestaltbar und leicht zu charakterisieren ist. Unter den verschiedenen Funktionen der RNA-Moleküle hat ihre Rolle als natürliche Riboschalter die Forscher vor allem dazu inspiriert, synthetische RNA-basierte Regulatoren zu entwerfen. Die meisten RNA-Vorrichtung enthalten ein Sensorelement, eine Aptamerdomäne, die kleine Moleküle oder Proteinliganden mit hoher Spezifität und Affinität erkennt, und eine Expressionsplattform, die die Genexpression mittels verschiedener Mechanismen steuert. Im Allgemeinen stabilisiert die Bindung eines spezifischen Liganden an die Aptamer-Domäne das RNA-Molekül oder verursacht Konformationsänderungen in seiner Struktur, die die Transkription, Translation und mRNA-Prozessierung und -Degradation weiter regulieren. RNA-basierte Geräte haben bereits zahlreiche Anwendungen in der synthetischen Biologie gezeigt. Ihre Implementierung wurde jedoch hauptsächlich in Bakterien und Hefe validiert, während die synthetische Biologie in Säugetieren hinterherhinkt. Die RNA stellt eines der leistungsstärksten Substrate bei der Entwicklung biologischer Systeme dar, da sie vielseitig, gestaltbar und leicht zu charakterisieren ist. Unter den verschiedenen Funktionen der RNA-Moleküle hat ihre Rolle als natürliche Riboschalter die Forscher vor allem dazu inspiriert, synthetische RNA-basierte Regulatoren zu entwerfen. Die meisten RNA-Geräte enthalten ein Sensorelement, eine Aptamerdomäne, die kleine Moleküle oder Proteinliganden mit hoher Spezifität und Affinität erkennt, und eine Expressionsplattform, die die Genexpression über verschiedene Mechanismen steuert. Im Allgemeinen stabilisiert die Bindung eines spezifischen Liganden an die Aptamer-Domäne das RNA-Molekül oder verursacht Konformationsänderungen in seiner Struktur, die die Transkription, Translation und mRNA-Prozessierung und -Degradation weiter regulieren. RNA-basierte Geräte haben bereits zahlreiche Anwendungen in der synthetischen Biologie gezeigt. Ihre Implementierung wurde jedoch hauptsächlich in Bakterien und Hefe validiert, während die synthetische Biologie bei Säugetieren hinterherhinkt. Das Spleißen von prä-mRNAs ist ein wesentlicher Prozess in menschlichen Zellen, der durch Netzwerke von koordinierten Spleißereignissen ein vielfältiges Proteom erzeugt und eine zusätzliche Kontrollebene für synthetische RNA-Geräte bietet. Die reprogrammierte Entfernung intronischer Sequenzen könnte einen neuen Ansatz für die Entwicklung von Gentherapien zur Bekämpfung von Krankheitsphänotypen bieten. Zu diesem Zweck ist es notwendig, Werkzeuge zu entwerfen, die eine präzise und rechtzeitige Kontrolle der Spleissmechanismen ermöglichen. Im ersten Forschungsprojekt, das in der vorgestellten Doktorarbeit beschrieben wird, wurde eine vielseitige und hocheffiziente Spleißvorrichtung entworfen, die eine Kontrolle der Genexpression in menschlichen Zellen ermöglicht und ein vom TetR erkanntes RNA-Aptamer verwendet. Weiterhin wurde die Portabilität der Spleißeinrichtung durch ihre Funktionalität in verschiedenen Reportersystemen und im endogenen Genkontext gezeigt. Im Rahmen der Arbeit wurde das erste induzierbare Modell zur alternativen 3'-Spleißstellenerkennung mit dem Tetracyclin-Repressor (TetR)-Aptamer generiert, das zur Herstellung von Spleißvarianten mit unterschiedlicher subzellulärer Lokalisation führt. Die Anwendbarkeit des Systems wurde in Experimenten bestätigt, die darauf abzielten, den Kernimport in menschliche Zellen zu kontrollieren. Der vorgeschlagene Ansatz könnte sich bei phänotypischen Studien wesentlicher Gene als wertvoll erweisen und eine Alternative bei der Entwicklung therapeutischer Strategien bieten, da der nukleo-zytoplasmatische Transport für die Aufrechterhaltung einer ausgewogenen Zellphysiologie von entscheidender Bedeutung ist, wobei eine aberrante räumlich-zeitliche Lokalisierung von Proteinen zur Entwicklung verschiedener Störungen und Krebs führen kann. Schliesslich konzentrierte sich das dritte Forschungsprojekt, das im Rahmen meiner Doktorarbeit durchgeführt wurde, auf die Entwicklung und Optimierung des TetR-Aptamer-abhängigen Translationskontrollsystems in menschlichen Zellen. Die Translationsregulation stellt einen wichtigen Punkt der posttranskriptionellen Kontrolle der Genexpression dar, der es der Zelle ermöglicht, das Niveau eines bestimmten Genprodukts rasch zu verändern. Bislang konnte kein effizientes, auf Aptamer-Liganden basierendes translatorisches Regulationssystem in Säugetierzellen nachgewiesen werden.

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