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Design, implementation and characterization of synthetic riboswitches in Saccharomyces cerevisiae

Schneider, Christopher :
Design, implementation and characterization of synthetic riboswitches in Saccharomyces cerevisiae.
[Online-Edition: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/6133]
Technische Universität Darmstadt , Darmstadt
[Dissertation], (2017)

Offizielle URL: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/6133

Kurzbeschreibung (Abstract)

The driving force of synthetic biology is the desire to build programmable cellular systems de novo modeled on their natural counterparts. To achieve this, environmental signals must be sensed and integrated to generate an appropriate output. Sensors and actuators can be created according to naturally occurring riboswitches. The implementation of systems that can process many inputs initially requires the availability of the corresponding sensor domains, called aptamers. Many of the currently used synthetic riboswitches rely on only a handful of ligands as their external input. It is therefore desirable to expand the toolbox by adding other ligand specificities. Harnessing the potential of in vitro selected aptamers to function as in vivo regulators in yeast, the current literature was screened for suitable synthetic and natural aptamers. Candidates were then assayed for their ability to reduce reporter gene expression at the translational level in presence of their cognate ligands, essentially functioning as a roadblock to the scanning ribosome in the 5’-UTR. The results revealed a wide range of basal expressions, but no switching phenotypes. Since the aptamers had not been adapted to the expression system, the results confirmed either the inability of most highly in vitro evolved aptamers to exhibit the structural changes necessary for riboswitching or the requirement of natural aptamers for a dedicated expression platform. In case of the in vitro generated neomycin aptamer, an in vivo screening yielded aptamers with regulatory activity. Following this example, ciprofloxacin-binding aptamers were subjected to the screening and one aptamer was found that exhibited 2-fold regulation. This aptamer was then subjected to further analysis. In an approach to improve existing riboswitches and derive rules for riboswitch design, dimers of the tetracycline riboswitch were set to control reporter expression by the described regulatory mechanisms. Modifying one riboswitch was sufficient to obtain a range of basal expressions levels and switching factors that could then be used to train a computational model based on data from more than 100 different constructs. After setting desired output parameters with respect to basal expression and switching factors the model computed corresponding sequences that were tested in a second iterative approach. These results partly mirrored the first data recording, but also showed that the model could reproduce the sequence-activity relationships learned from the first recording. Moreover, non-regulating sequences were almost completely erased and the abundance of switches with desired switching factors was increased. Leaving the refinement of riboswitches at the nucleotide level, a third study was conducted to elucidate the performance of a logic NOR gate constructed from the neomycin and tetracycline riboswitches at the device level. A descriptor for the performance of this RNA logic gate was sought to be applied to assess its functionality at the single-cell level, since the correct functionality of (RNA) devices in each single cell is a prerequisite for their adaption to a genetic circuit. To this end the Receiver-Operator-Characteristics (ROC) analysis was identified as a suitable performance measure to account for cell-to-cell variability compromising the full separation of two Boolean states by overlapping populations. Complemented by the transient induction and repression kinetics of the constructed NOR gate recorded by flow cytometry and microfluidics-based fluorescence microscopy, data was derived that allowed mapping the performance of the NOR gate with respect to speed and accuracy of the logic operation. In most studies only steady state data from bulk cultures are collected and these information are lost. A hierarchical stochastic model was built and calibrated with the transient single-cell data that enabled the in silico completion of the device characterization at the steady state level for various induction levels and repressor concentrations. In general, such data can then be used to simulate the experimentally inaccessible gate performance. Additionally, the model facilitated the computational investigation of a possible re-design of the gate for which the model prediction proved to be correct in vivo, highlighting both the appropriateness of the experiment design to obtain meaningful data and the applicability of in silico approaches to predict the correct in vivo phenotype.

Typ des Eintrags: Dissertation
Erschienen: 2017
Autor(en): Schneider, Christopher
Titel: Design, implementation and characterization of synthetic riboswitches in Saccharomyces cerevisiae
Sprache: Englisch
Kurzbeschreibung (Abstract):

The driving force of synthetic biology is the desire to build programmable cellular systems de novo modeled on their natural counterparts. To achieve this, environmental signals must be sensed and integrated to generate an appropriate output. Sensors and actuators can be created according to naturally occurring riboswitches. The implementation of systems that can process many inputs initially requires the availability of the corresponding sensor domains, called aptamers. Many of the currently used synthetic riboswitches rely on only a handful of ligands as their external input. It is therefore desirable to expand the toolbox by adding other ligand specificities. Harnessing the potential of in vitro selected aptamers to function as in vivo regulators in yeast, the current literature was screened for suitable synthetic and natural aptamers. Candidates were then assayed for their ability to reduce reporter gene expression at the translational level in presence of their cognate ligands, essentially functioning as a roadblock to the scanning ribosome in the 5’-UTR. The results revealed a wide range of basal expressions, but no switching phenotypes. Since the aptamers had not been adapted to the expression system, the results confirmed either the inability of most highly in vitro evolved aptamers to exhibit the structural changes necessary for riboswitching or the requirement of natural aptamers for a dedicated expression platform. In case of the in vitro generated neomycin aptamer, an in vivo screening yielded aptamers with regulatory activity. Following this example, ciprofloxacin-binding aptamers were subjected to the screening and one aptamer was found that exhibited 2-fold regulation. This aptamer was then subjected to further analysis. In an approach to improve existing riboswitches and derive rules for riboswitch design, dimers of the tetracycline riboswitch were set to control reporter expression by the described regulatory mechanisms. Modifying one riboswitch was sufficient to obtain a range of basal expressions levels and switching factors that could then be used to train a computational model based on data from more than 100 different constructs. After setting desired output parameters with respect to basal expression and switching factors the model computed corresponding sequences that were tested in a second iterative approach. These results partly mirrored the first data recording, but also showed that the model could reproduce the sequence-activity relationships learned from the first recording. Moreover, non-regulating sequences were almost completely erased and the abundance of switches with desired switching factors was increased. Leaving the refinement of riboswitches at the nucleotide level, a third study was conducted to elucidate the performance of a logic NOR gate constructed from the neomycin and tetracycline riboswitches at the device level. A descriptor for the performance of this RNA logic gate was sought to be applied to assess its functionality at the single-cell level, since the correct functionality of (RNA) devices in each single cell is a prerequisite for their adaption to a genetic circuit. To this end the Receiver-Operator-Characteristics (ROC) analysis was identified as a suitable performance measure to account for cell-to-cell variability compromising the full separation of two Boolean states by overlapping populations. Complemented by the transient induction and repression kinetics of the constructed NOR gate recorded by flow cytometry and microfluidics-based fluorescence microscopy, data was derived that allowed mapping the performance of the NOR gate with respect to speed and accuracy of the logic operation. In most studies only steady state data from bulk cultures are collected and these information are lost. A hierarchical stochastic model was built and calibrated with the transient single-cell data that enabled the in silico completion of the device characterization at the steady state level for various induction levels and repressor concentrations. In general, such data can then be used to simulate the experimentally inaccessible gate performance. Additionally, the model facilitated the computational investigation of a possible re-design of the gate for which the model prediction proved to be correct in vivo, highlighting both the appropriateness of the experiment design to obtain meaningful data and the applicability of in silico approaches to predict the correct in vivo phenotype.

Ort: Darmstadt
Fachbereich(e)/-gebiet(e): 10 Fachbereich Biologie
10 Fachbereich Biologie > Synthetic Genetic Circuits
LOEWE > LOEWE-Schwerpunkte > CompuGene – Computer-gestützte Verfahren zur Generierung komplexer genetischer Schaltkreise
Hinterlegungsdatum: 09 Apr 2017 19:55
Offizielle URL: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/6133
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-61339
Gutachter / Prüfer: Süß, Prof. Dr. Beatrix ; Köppl, Prof. Dr. Heinz
Datum der Begutachtung bzw. der mündlichen Prüfung / Verteidigung / mdl. Prüfung: 4 April 2017
Alternatives oder übersetztes Abstract:
AbstractSprache
Eine der treibenden Kräfte in der Synthetischen Biologie ist das Bestreben programmierbare Zellsysteme nach ihren natürlichen Vorbildern zu konstruieren. Um dies zu erreichen müssen Systeme enwickelt werden, die sensitiv auf Umwelteinflüsse reagieren und die empfangenen Signale prozessieren. Entsprechende Sensoren und Reglereinheiten können gemäß natürlich vorkommenden RNA-Schaltern, so genannten Riboswitches, generiert werden. Die Etablierung von Systemen, die mehrere verschiedene Signale verarbeiten können, erfordert zunächst die Verfügbarkeit geeigneter Sensoren, z.B. RNA Aptamere. Viele der derzeit verwendeten synthetischen Riboswitches können nur wenige verschiedene Liganden wahrnehmen, die dementsprechend als Input genutzt werden können. Die Erweiterung des Repertoires and nutzbaren Liganden ist ein unabdingbarer Schritt hin zur Implementierung entsprechender Regelkreise. Die Eigenschaft in vitro-generierter Aptamere auch gleichzeitig als Regulatoren in Hefen verwendet werden zu können, wurde genutzt um die aktuelle Literatur auf geeignete synthetische und natürliche Aptamere zu durchsuchen. Identifizierte Kandidaten wuden hinsichtlich ihrer Eignung die Expression eines Reportergens in Anwesenheit ihrer spezifischen Liganden zu verringern getestet. Diese Regulation auf translationaler Ebene basiert auf der Blockade des Translationsinitiationskomplexes, während dieser die mRNA auf der Suche nach dem Translationsstartpunkt abtastet. Zwar konnten verschiedenste Basalexpressionen ermittelt werden, jedoch blieb die Entdeckung eines regulatorischen Phänotyps aus. Diese Ergebnisse bestätigen zum einen, dass in vitro hochevolvierte Aptamere nicht in der Lage sind ihre Struktur dahingehend zu ändern, dass sie eine Genregulation herbeiführen können und zum anderen, dass natürliche Aptamerdomänen eine dedizierte Expressionsplattform für ihre Aktivität benötigen. Im Falle des in vitro generierten Neomycin-Aptamers ermöglichte ein in vivo Screening Ansatz jedoch Identifikation von Aptameren, die regulatorische Aktivität aufwiesen. Gemäß dieses Beispieles wurde ein in vivo Screening mit Ciprofloxacin-bindenden Aptamere durchgeführt. Auf diese Weise konnte ein Aptamer identifiziert werden, das eine 2-fache Genregulation zeigte. In einem weiteren Ansatz zur Verbesserung bereits verwendeter Riboswitches und mit dem Ziel Regel für die Riboswitch-Konstruktion zu ermitteln, wurden Dimere des Tetrazyklin-bindenenden Riboswitches in einem Reportergenassay untersucht, der den bereits beschriebenen Regulationsmechanismus auf translationaler Ebene verwendet. Bereits die Modifikation eines der beiden Riboswitches genügte um eine groβE Bandbreite an Basalexpressionen und Schaltfaktoren zu erhalten. Die von mehr als 100 Konstrukten erhobenen Daten wurde im Anschluss genutzt um ein Computermodell zu trainieren. Nachdem Werte für die Parameter Basalexpression und Schaltfaktor festgesetzt worden waren, die für eine Verbesserung der regulatorischen Aktivität nötig sind, klassifizierte das Computermodell entsprechende Sequenzen aus einem randomisierten Sequenzraum, die im Anschluss in vivo getestet wurden. Diese Ergebnisse spiegelten teilweise die erste Datenaufnahme wider, zeigten jedoch zugleich, dass das Computermodell die erlernten Sequenz-Aktivitäts-Beziehungen wiedergeben konnte. Überdies konnten regulatorisch inaktive Sequenzen praktisch komplett eliminiert und die Häufigkeit von Schaltern mit gewünschten Phänotypen erhöht werden. Der beschriebene Ansatz zur Verbesserung von existierenden Riboswitches wurde auf Einzelnukleotidebene durchgeführt. In einer dritten Studie sollte die regulatorische Leistung eines logischen NOR Gatters bestehend aus Neomycin- und Tetrazyklin-bindenden Riboswitches auf Ebene des Logikgatters untersucht werden. Ein Deskriptor für die regulatorische Leistung des beschriebenen Gatters sollte angewendet werden um seine Funktion auf Einzelzellebene zu bestimmen, da die korrekte Funktionalität von (RNA-) Gattern eine unabdingbare Voraussetzung für ihre Verwendung in einem genetischen Schaltkreis darstellt. In diesem Zusammenhang wurde die Empfänger-Operator-Charakteristik (Receiver-Operator-Characteristics, ROC) Analyse als geeigneter Deskriptor identifiziert, um die Variabilität zwischen Einzelzellen, die die vollständige Trennung von zwei Logikzuständen durch Überlappung der beteiligten Populationen erschweren, zu berücksichtigen. Vervollständigt durch die transiente Messung der Induktions- und Repressionskinetiken des konstruierten NOR-Gatters mittels Durchflusszytometrie und Mikrofluidik-basierter Fluoreszenzspektroskopie, konnten die aufgenommenen Daten zur Charakterisierung der regulatorischen Leistung hinsichtlich Geschwindigkeit und Genauigkeit der Logikverarbeitung genutzt werden. Die meisten Studien verwenden nur Endpunktmessungen einer Bulkkultur, in der diese Daten nicht zu differenzieren und dementsprechend nicht zugänglich sind. Anhand der transienten Einzelzelldaten wurde ein hierarchisches stochastisches Modell konstruiert und kalibriert, das die in silico Vervollständigung der Gattercharakterisierung im Gleichgewichtszustand der beteiligten Komponenten über verschiedene Induktionslevel und Repressorkonzentrationen ermöglichte. General können solche Daten genutzt werden um experimentell unzugängliche Leistungsdaten zu erhalten. Darüber hinaus erlaubte das Modell die Computer-gestützte Untersuchung eines möglichen Neudesigns des Gatters, das nach experimenteller Umsetzung die Vorhersage des Modells bestätigte. Dies hebt sowohl die Eignung des experimentellen Aufbaus geeignete Daten zu generieren, als auch die Anwendbarkeit von computergestützen Ansätzen den korrekten in vivo Phänotyp zu bestimmen, hervor.Deutsch
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