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Development of biomarkers and their application to the study of chromatin epistate effect on DNA damage and repair

Rajan, Malini (2015)
Development of biomarkers and their application to the study of chromatin epistate effect on DNA damage and repair.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

Direct live cell analysis markers are very important for the better understanding of cellular processes and pathways. In this thesis we describe the development and characterization of live cell markers and their application to the study of interplay between chromatin epistate and DNA damage and repair. Initially, we did an in vivo characterization of γ-H2AX nanobody (heavy chain antibodies from alpacas) based live cell DNA double strand break marker. As so far the analysis of the post-translational modifications of histone H2AX (γ-H2AX) involved in DNA double strands breaks, was not studied in living cells, we used nanobodies as a tool. These single chain nanobodies can be genetically encoded and fused to a fluorescent tag, which can then be used to detect and trace proteins and other cellular components in vivo. After in vivo characterization, we found that epitope recognition was competed by endogenous proteins recognzing the same modification (e.g., MDC1) and suffered also from alternative binding to mimicking SQ motifs present in proteins such as XRCC1 repair factor. In parallel, a novel live cell marker for DNA replication and repair was developed by targeting the PCNA factor using cell penetrating peptide technology. PCNA is a key protein involved in DNA replication and repair pathways. Cells transfected with the fluorescent fusions of PCNA are widely used. To prevent the need for prior transfection and circumvent the problem of difficult to transfect and/or short lived cells, we developed and validated a cell permeable PCNA interacting peptide. This is the first ever attempt in developing an instantaneous biomarker, which needs only seconds to label the target. To further extend the applicability of the cell penetrating peptide system for site specific labeling of any recombinant histidine tagged as well as naturally existing histidine rich proteins in living cells, tris-nitrilotriacetic acid (NTA) probes was used. Here, we also optimized a labeling protocol so that histidine tagged proteins overexpressed in cells can be labeled with fluorescently tagged trisNTA in fixed and living cells. Finally, we explored DNA damage and repair in the context of open and closed chromatin states achieved by incorporation of different histone H2A variants (canonical H2A versus H2A.Bbd). Our established replication/repair marker was used here to test its co-localization with replication factors like PCNA. On a first set of experiments we analyzed DNA replication. Our data suggested that H2A.Bbd is enriched in the sites of active DNA replication leading to shortened S phase duration. On a second set of experiments, H2A.Bbd-GFP expressing cells were found to be more sensitive than H2A-GFP when exposed to UVC, The sensitivity was quantified by the level of cyclobutane pyrimidine dimer (CPD). Based on these results we hypothesized the reason for this increased damage could be due to more open chromatin comprising the H2A.Bbd and, on the other hand, the decreased damage due to more condensed chromatin comprising H2A. Hence, for the validation of our hypothesis we reversed the chromatin condensation states in both stable cell lines, i.e., we induced condensation of the chromatin of H2A.Bbd overexpressing cell lines and decondensation of the chromatin of H2A. overexpressing cell lines. Subsequent CPD damage analysis supported our hypothesis. The open chromatin nature leading to increased DNA damage susceptibility and shortened S-phase corelated with phenotypic characteristics of Hodgkin lymphoma cells known to overexpress H2A.Bbd.

Typ des Eintrags: Dissertation
Erschienen: 2015
Autor(en): Rajan, Malini
Art des Eintrags: Erstveröffentlichung
Titel: Development of biomarkers and their application to the study of chromatin epistate effect on DNA damage and repair
Sprache: Englisch
Referenten: Cristina, Prof. Dr. Cardoso ; Heribert, Prof. Dr. Warszecha
Publikationsjahr: 27 Februar 2015
Datum der mündlichen Prüfung: 13 Februar 2015
URL / URN: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/4426
Kurzbeschreibung (Abstract):

Direct live cell analysis markers are very important for the better understanding of cellular processes and pathways. In this thesis we describe the development and characterization of live cell markers and their application to the study of interplay between chromatin epistate and DNA damage and repair. Initially, we did an in vivo characterization of γ-H2AX nanobody (heavy chain antibodies from alpacas) based live cell DNA double strand break marker. As so far the analysis of the post-translational modifications of histone H2AX (γ-H2AX) involved in DNA double strands breaks, was not studied in living cells, we used nanobodies as a tool. These single chain nanobodies can be genetically encoded and fused to a fluorescent tag, which can then be used to detect and trace proteins and other cellular components in vivo. After in vivo characterization, we found that epitope recognition was competed by endogenous proteins recognzing the same modification (e.g., MDC1) and suffered also from alternative binding to mimicking SQ motifs present in proteins such as XRCC1 repair factor. In parallel, a novel live cell marker for DNA replication and repair was developed by targeting the PCNA factor using cell penetrating peptide technology. PCNA is a key protein involved in DNA replication and repair pathways. Cells transfected with the fluorescent fusions of PCNA are widely used. To prevent the need for prior transfection and circumvent the problem of difficult to transfect and/or short lived cells, we developed and validated a cell permeable PCNA interacting peptide. This is the first ever attempt in developing an instantaneous biomarker, which needs only seconds to label the target. To further extend the applicability of the cell penetrating peptide system for site specific labeling of any recombinant histidine tagged as well as naturally existing histidine rich proteins in living cells, tris-nitrilotriacetic acid (NTA) probes was used. Here, we also optimized a labeling protocol so that histidine tagged proteins overexpressed in cells can be labeled with fluorescently tagged trisNTA in fixed and living cells. Finally, we explored DNA damage and repair in the context of open and closed chromatin states achieved by incorporation of different histone H2A variants (canonical H2A versus H2A.Bbd). Our established replication/repair marker was used here to test its co-localization with replication factors like PCNA. On a first set of experiments we analyzed DNA replication. Our data suggested that H2A.Bbd is enriched in the sites of active DNA replication leading to shortened S phase duration. On a second set of experiments, H2A.Bbd-GFP expressing cells were found to be more sensitive than H2A-GFP when exposed to UVC, The sensitivity was quantified by the level of cyclobutane pyrimidine dimer (CPD). Based on these results we hypothesized the reason for this increased damage could be due to more open chromatin comprising the H2A.Bbd and, on the other hand, the decreased damage due to more condensed chromatin comprising H2A. Hence, for the validation of our hypothesis we reversed the chromatin condensation states in both stable cell lines, i.e., we induced condensation of the chromatin of H2A.Bbd overexpressing cell lines and decondensation of the chromatin of H2A. overexpressing cell lines. Subsequent CPD damage analysis supported our hypothesis. The open chromatin nature leading to increased DNA damage susceptibility and shortened S-phase corelated with phenotypic characteristics of Hodgkin lymphoma cells known to overexpress H2A.Bbd.

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Zum besseren Verständnis zellulärer Prozesse ist es wichtig für Lebendzell-Experimente auf gute und verlässliche Marker für zelluläre Strukturen und Prozesse zurückgreifen zu können. In Rahmen dieser Thesis beschreiben wir die Entwicklung und Charakterisierung solcher Marker, die zur Untersuchung der DNA-Replikation sowie von DNA-Reparatur-Prozessen in lebenden Zellen verwendet werden können. Der Fokus liegt hierbei auf der Untersuchung von Chromatinveränderungen während der DNA-Reparatur. Hierfür wurde zuerst ein Nanobody (Einzeldomänen-Antikörper aus Camelidae) gegen die posttranslational phosphorylierte Form der Histonvariante H2AX, γ-H2AX, die als Indikator für DNA-Doppelstrangbrüche dient, in vivo charakterisiert. Bisher wurde der Phosphorylierungstatus der Histonvariante H2AX lediglich in fixierten Zellen mittels Immunofluoreszensfärbung untersucht. Nanobodies können rekombinant an fluoreszente Proteine gekoppelt werden und entsprechend genutzt werden, um Proteine oder andere zelluläre Bestandteile zu visualisieren. Im Zuge der in vivo Charakterisierung des γ-H2AX Nanobodys taten sich zwei große Probleme bei der Epitop-Erkennung auf. So wird das Epitop des Nanobodys kompetitiv von anderen Proteinen wie MDC1 gebunden. Außerdem bindet der Nanobody das von ihm erkannte SQ-Motiv auch in anderen Reparaturproteine, wie beispielsweise XRCC1. Parallel zur Nanobody-Charakterisierung wurde ein, auf zellpenetrierenden Peptiden basierender, Marker für Lebendzell-Studien zu DNA-Replikation und DNA-Reparatur entwickelt. Hierfür fokussierten wir uns auf PCNA, ein Schlüsselprotein der DNA-Replikation und der DNA-Reparatur welches häufig als fluoreszentes Fusions-Protein überexprimiert eingesetzt wird. Um die Transfektion von Zellen und die damit verbunden Probleme, wie schlechte Transfektionsraten und Auswirkungen auf das Zellüberleben zu umgehen, entwickelten wir ein zellpermeables, mit PCNA interagierendes Peptid das in Studien zu DNA-Replikation und DNA-Reparatur benutzt werden kann. Dabei handelte es sich um das erste Experiment überhaupt in dem erfolgreich ein Biomarker entwickelt wurde, der innerhalb von Sekunden gewünschte Zielstrukturen sichtbar macht. Um diese Anwendungsmöglichkeiten zellpenetrierender Peptide noch zu erweitern und rekombinat mit einem Histidin-Tag versehene Proteine oder natürlich Histidin-reiche Proteine zu markieren, wurden Nitriloessigsäure (NTA) basierte Sonden in lebenden Zellen getestet. Außerdem wurde ein Färbeprotokoll optimiert, um sowohl in lebenden als auch in fixierten Zellen überexprimierte Proteine mit Histidin-Tag und auch endogen, Histidin-reiche Proteinen mit Hilfe eines, an die NTA gekoppelten, fluoreszierenden Moleküls sichtbar zu machen. Letztlich untersuchten wir noch DNA Reparaturmechanismen im Kontext offener und geschlossener Chromatinregionen in denen die erst kürzlich entdeckte Isoform von Histon H2A, H2A.Bbd, vorkommt. Hierfür wurde der von uns etablierte Replikations- und Reparatur-Marker benutzt um Lokalisationsstudien von endogenem PCNA durchzuführen. In einem ersten Experiment untersuchten wir die DNA Replikation. Hier legen unsere Daten eine Anreicherung von H2A.Bbd in Regionen mit aktiver DNA Replikation nahe, was in einer verkürzten S-Phase resultiert. In weiteren Experimenten zeigte sich, dass eine Zelllinie, die stabil H2A.Bbd-GFP überexprimierte, sensitiver auf UVC-Bestrahlung reagierte, als stabil H2A-GFP überexprimierenden Zellen, was an Hand der Level von Cyclobutan-Pyrimidn-Dimeren (CPD) quantifiziert wurde. Dies wurde dem weniger stark kondensierten Chromatin in den H2A.Bbd-Zellen zugeschrieben. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden die Chromatin-Kondensationslevel der beiden Zelltypen invertiert, also eine Kondensation des Chromatins in H2A.Bbd-Zellen und eine Auflockerung der Chromatinstruktur in den H2A-Zellen herbeigeführt. Die anschließende Analyse der Cyclobutan-Pyrimidin-Dimer Level stütze diese Hypothese. Die offene Chromatin-Struktur, die H2A.Bbd überexprimierende Zelle anfälliger für DNA Schäden macht sowie die verkürzte S-Phase Dauer spiegelt die phänotypischen Charakteristika von Hodgkin Lymphomen wieder, in denen ebenfalls eine H2A.Bbd-Überexpression beobachtet wird.

Deutsch
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-44263
Sachgruppe der Dewey Dezimalklassifikatin (DDC): 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Fachbereich(e)/-gebiet(e): 10 Fachbereich Biologie
10 Fachbereich Biologie > Cell Biology and Epigenetics
Hinterlegungsdatum: 22 Mär 2015 20:55
Letzte Änderung: 22 Mär 2015 20:55
PPN:
Referenten: Cristina, Prof. Dr. Cardoso ; Heribert, Prof. Dr. Warszecha
Datum der mündlichen Prüfung / Verteidigung / mdl. Prüfung: 13 Februar 2015
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