Proteomanalyse der Blut-Hirn-Schranke

Märten, Stefan (2004)
Proteomanalyse der Blut-Hirn-Schranke.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

URL / URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-4101

Kurzbeschreibung (Abstract)

Als Sinnesorgan erfüllt das Gehirn einzigartige Funktionen. Es steuert den Organismus, ist Sitz von Gedächtnis und Bewusstsein und erlaubt es uns, aus Kenntnis der Vergangenheit eine Projektion der Zukunft zu entwickeln. Diese Funktionen finden ihr Korrelat in einem komplexen Aufbau, der von dem Zusammenspiel von Nerven, Gliazellen und Blutkapillaren bestimmt wird. Nachdem das Humangenom entziffert wurde, versucht man z. Zt. die Identität aller im Gehirn agierender Proteine zu klären. Um diesen komplexen Ansatz zu vermeiden, haben wir uns besonders auf die Funktion der Blut-Hirn-Schranke beschränkt. Allerdings haben die Ergebnisse der letzten Jahre gezeigt, dass auch dieser Ansatz zu komplex ist. So soll in der vorliegenden Dissertation nur ein definiertes Areal, die sog. Lipid rafts, ein Bereich der Membranen von Endothelzellen (BMEC), untersucht werden. Publizierte Daten lassen vermuten, dass an diesen Stellen ein besonders aktiver Stofftransport abläuft. Als Methode wurde die vergleichende Proteomanalyse von kultivierten Zellen gewählt. Letztere verlieren mit fortschreitender Kultivierungsdauer ihre Schrankeneigenschaften, was durch Aktivitätstests und Immunfärbungen gezeigt werden konnte. Durch die Isolierung der Lipid rafts aus den Passagen 0 und 2 gelang es, Proteine anzureichern, die an Signal- und Transportprozessen beteiligt sind. Sie wurden zuerst mittels einer SDS-Gelelektrophorese nach Größe fraktioniert. Nach Ausschneiden der Proteinbanden und Trypsin-Hydrolyse konnten die HPLC-getrennten Fragmente mit ESI-MS massenspektrometrisch analysiert werden. Die Identität der Proteine wurde durch Datenbankabgleich ermittelt. Näher untersucht wurden das Caveolin als Markerprotein der Lipid raft-Fraktion, GLUT-1 als Transportprotein für Glukose und ein von der Lokalisation her gesehen neuerer ABC-Transporter. Bioinformatische Untersuchungen zeigten bei diesem Transporter das Vorhandensein einer sog. Caveolin-Bindedomäne. Zusätzlich erfolgte die Etablierung einer Phage-Display-Bank ausgehend von humaner DNA. Hierbei wurde über kombinatorisch synthetisierte Primer eine Diversität in der Antigen-Bindestelle von single chain-Antikörpern erzeugt, die schließlich auf Phagen präsentiert vorlagen. Durch eine bisher nicht beschriebene Selektion gegen die LR-Fraktion wurde die Funktionalität der Bank demonstriert. Dabei konnte ein Phage mit einem Antikörperfragment gegen das non-muscle-Myosin isoliert und die Spezifität des Fragments über Western Blot und Immunhistochemie erfolgreich gezeigt werden.

Typ des Eintrags:

Dissertation

Erschienen:

2004

Autor(en):

Märten, Stefan

Art des Eintrags:

Erstveröffentlichung

Titel:

Proteomanalyse der Blut-Hirn-Schranke

Sprache:

Deutsch

Referenten:

Friedl, Prof. Dr. P.

Berater:

Gassen, Prof. Dr. H. G.

Publikationsjahr:

18 Februar 2004

Ort:

Darmstadt

Verlag:

Technische Universität

Datum der mündlichen Prüfung:

19 Januar 2004

URL / URN:

urn:nbn:de:tuda-tuprints-4101

Kurzbeschreibung (Abstract):

Alternatives oder übersetztes Abstract:

Alternatives Abstract

Sprache

The Brain possesses unique functions. It controls the organism and it is the location of the memory and consciousness. Due to the knowledge of the past, it allows a projection of the future. These functions require a complex structure that is composed of blood vessels, nerve and glia cells. After the completion of the human genome project one task is to identify the proteins of the brain. In order to avoid this complex approach we are concentrating on the function of the blood-brain barrier. Recent results showed that even this attempt is too complex. Aim of this thesis is to examine the lipid rafts as a defined area of the plasma membrane of brain microvascular endothelial cells (bmec). The Lipid rafts are involved in several transport processes. A comparative proteomic method of cultured cells was chosen. Cultured cells loose their specific barrier properties during cultivation. This was shown by activity assays and immunochemistry. An enrichment of proteins participating in signaling- and transport processes was achieved by isolating Lipid rafts of passage 0 und passage 2. The proteins were separated by SDS-polyacrylamide-gel-electrophoresis. Excised protein-bands were hydrolysed by Trypsin and separated using HPLC. Eluted Peptides were analysed by ESI-MS. The Proteins were identified by database matching. A closer examination was carried out with Caveolin-1, known marker protein of the Lipid rafts, GLUT1 as a transport protein of glucose and from the point of localisation new ABC-transport protein. Bioinformatic studies of this transport-protein showed the existence of a Caveolin-binding domain. Furthermore, a phage display library was established originating from human DNA. Combinatorical synthesised primer achieved the diversity in the Antigen-binding-site of the single-chain antibodies. These antibodies were presented on the surface of phages. Through a so far not described panning process against the Lipid rafts the functionality of the library was demonstrated. A phage with an scFv-antibody against non-muscle myosin was isolated and the specificity was shown using Western Blot-analysis and immunohistochemistry.

Englisch

Freie Schlagworte:

lipid rafts, Glut1

Schlagworte: