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Schwefel und Persulfid (Di-) Oxygenasen: Biochemische, spektroskopische und strukturelle Eigenschaften und deren Einfluss auf die Reaktionsmechanismen

Rühl, Patrick (2020):
Schwefel und Persulfid (Di-) Oxygenasen: Biochemische, spektroskopische und strukturelle Eigenschaften und deren Einfluss auf die Reaktionsmechanismen.
Darmstadt, Technische Universität,
DOI: 10.25534/tuprints-00011493,
[Ph.D. Thesis]

Abstract

Als Schwefel (Di-)Oxygenasen waren ursprünglich zwei Enzymklassen beschrieben worden, die elementaren Schwefel (S0) mit Sauerstoff (O2) oxidieren. Sie gehören zu der sehr viel größeren Gruppe sogenannter „Schwefel-oxidierender Enzyme“, unter denen alle Enzyme zusammengefasst sind, die reduzierte Schwefelverbindungen oxidieren. Die hier untersuchten Schwefel Oxygenasen Reduktasen (SORs) und Persulfid Dioxygenasen (PDOs) ähneln sich darin, dass sie mononukleare nicht-Häm Eisenatome besitzen, welche die S0- bzw. Persulfid-Oxidation mit O2 in den jeweiligen aktiven Zentren katalysieren. Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel, Vertreter beider nicht verwandter Enzymklassen auf molekularer und struktureller Ebene im Detail zu charakterisieren, um Rückschlüsse auf generelle Funktionsweisen und die Reaktionsmechanismen zu erhalten.

PDOs kommen in der Natur ubiquitär vor und katalysieren die sauerstoffabhängige Oxidation des Sulfanschwefels von Glutathionpersulfid (GSSH), das aus reduziertem Glutathion (GSH) durch Sulfanschwefel-Transferasen oder auch spontan mit S0 entsteht. Reaktionsprodukte der PDOs sind Sulfit und GSH. Das pdo-Gen aus Acidithiobacillus caldus (AcPDO) wurde heterolog in E. coli exprimiert, mit durchschnittlichen Proteinausbeuten von ≈ 27,9 mg/l LB-Medium. Der mittlere Eisengehalt der rekombinanten Proteine betrug 0,77 nmol Fe/nmol Protein bei einer Enzymaktivität von 61,0 U/mg Protein bei 40 °C und pH 7,5. Enzymtests mit steigenden GSH-Konzentrationen und S0 als Co-Substrat resultierten in einer Michaelis-Menten-Kinetik mit KM und Kcat von 0,5 mM und 181 s-1, wohingegen steigende GSSH-Konzentrationen einen sigmoidalen Kurvenverlauf mit einem Hill-Koeffizienten von 2,3 zur Folge hatte, was auf positive Kooperativität der Enzymuntereinheiten hindeutet. Die AcPDO-Röntgenkristallstruktur wurde mit einer Auflösung von 2,07 Å aufgeklärt, deren asymmetrische Einheit aus einem Homodimer besteht. Die Kristallpackung der Einheitszelle und Gelfiltration legen eine Tetramerisierung nahe, welche über Oberflächenladungen und hydrophobe Interaktionen vermittelt wird. Das katalytische high-spin Eisenatom wird in einer 2-His-1-Carboxylat-Triade ligiert und besitzt ein Reduktionspotential E0‘ von -234 mV. Spektroskopische Analysen zeigten charakteristische Ladungstransfer-Spezies nach Inkubation mit GSSH, welche auf Fe-O2 und Fe-O2-SSR-Intermediate zurückzuführen sind und legten die Bildung eines Fe(IV)-Reaktionsintermediates nahe. In einer ersten, umfassenden PDO-Mutagenese-Studie wurden insgesamt zehn funktional wichtige Aminosäuren identifiziert, von denen D61, H62 und H171 konserviert und essentiell sind. Sie befinden sich in zwei active site loops in unmittelbarer Nähe zum Eisenzentrum und sind vermutlich über Säure-Base-katalysiertes Protonen-Shuffling direkt an der homolytischen Spaltung eines zyklischen Peroxo-Reaktionsintermediates beteiligt. Substratbindungsanalysen gaben einen KD-Wert von 113 µM für die GSSH Bindung an, wobei eine Alanin-Variante des in der Substratbindungstasche befindlichen R139 einen starken Abfall der Enzymaktivität bewirkte und nicht mehr in der Lage war, Substrat zu binden. Oberflächen-Cysteine befinden sich in beachtlichen Abstand zum aktiven Zentrum (>16 Å) und bilden in der AcPDO-3D-Struktur eine Disulfidbrücke aus. Gel-Shift-Assays zeigten, dass es sich um ein redoxaktives Zentrum handelt. Die Disulfidbrücke stabilisiert eine α-Helix und koordiniert über N221 die Position von D61 und H62. Alanin-Varianten der beiden Cysteine besaßen verbleibende Enzymaktivitäten von <2 % und zeigten nach GS(S)H-Inkubation massenspektrometrisch eine Glutathionylierung am jeweils verbleibenden Cystein. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Protein-S-Glutathionylierung als Schutzmechanismus gegen unkontrollierte Thiol-Oxidation und dem damit verbundenen Verlust der Enzymaktivität fungiert.

SORs katalysieren eine sauerstoffabhängige Disproportionierungsreaktion von S0 mit Sulfit und Sulfid als Reaktionsprodukte. Normalerweise besitzen SORs Produktstöchiometrien zwischen 4:1 und 10:1, wobei Oxygenase- und Reduktase-Aktivitäten bislang nicht voneinander getrennt werden konnten. Sequenzvergleiche zeigten, dass die SOR aus dem mesophilen Bakterium Thioalkalivibrio paradoxus ARh1 (TpSOR) tief in SOR-Dendrogrammen abzweigt. SWATH-LC/MS/MS-Analysen zeigten, dass die TpSOR – im Gegensatz zu PDOs – in großen Mengen in Kulturen mit Thiosulfat bzw. Thiocyanat als Energiequelle gebildet wird. Sie scheint, zusammen mit revers arbeitender Sulfitreduktase, Adenylylsulfatreduktase und periplasmatischen Flavocytochromen c, eine zentrale Rolle im oxidativen Schwefelmetabolismus von Tv. paradoxus einzunehmen, wobei deren Abundanz eng mit dem Auf- und Abbau intrazellulärer Schwefelkugeln korreliert. Die TpSOR wurde rekombinant in E. coli produziert, mit durchschnittlichen Proteinausbeuten von ≈ 30,9 mg/l LB-Medium. Die mittlere Oxygenase-Aktivität betrug 323 U/mg Protein bei 80 °C und pH 9. Der Schmelzpunkt der TpSOR wurde bei 81 °C ermittelt und befindet sich damit nahe des Temperaturoptimums. Die TpSOR-Reduktase-Aktivität betrug in kolorimetrischen Quantifizierungen der Reaktionsprodukte maximal 0,03 U/mg Protein, was < 1 % im Vergleich zu allen anderen SORs und einem Oxygenase/Reduktase-Verhältnis von ≈ 10 000:1 entspricht. Um reproduzierbare Produktstöchiometrien in SORs zu ermitteln, wurde ein HPLC-gekoppelter SOR-Enzymtest entwickelt. Quantifizierungen der Reaktionsprodukte resultieren in Produktverhältnissen von 30:1 für die TpSOR, wohingegen SORs aus dem hyperthermophilen Archaeon Acidianus ambivalens (AaSOR) und dem mesophilen Bakterium Halo-thiobacillus neapolitanus für die S0-Disproportionierungsreaktion erwartete Verhältnisse von nahezu 1:1 aufwiesen. Dementsprechend scheint die TpSOR eine Schwefel Oxygenase mit einer untypisch geringen Reduktase-Aktivität darzustellen. Die TpSOR-Röntgenkristallstruktur wurde mit einer Auflösung von 2,84 Å aufgeklärt und zeigte einen SOR-typischen Aufbau. Das mononukleare Eisenzentrum befindet sich in einer deformierten oktaedrischen Koordinationssphäre mit einem Reduktionspotential E0‘ von -252 mV und liegt, im Unterschied zur AaSOR, nach Katalyse oxidiert vor. Unterschiede im Vergleich zu anderen SORs ergeben sich in der Konstitution der active site pocket, welche in der TpSOR durch einen interhelikalen loop unterbrochen ist. Die verkleinerte Bindungstasche schließt lediglich das für die Reaktion essentielle C44 ein und könnte Reaktionsprodukte oder -intermediate vor chemischer Oxidation/Reduktion schützen. Darüber hinaus wurde in allen drei SORs mittels Software-gestützten Tunnelanalysen ein zuvor unbekannter Zugang zum aktiven Zentrum identifiziert, welcher über das essentielle Cystein eine zweite Kavität mit der ative site pocket verbindet. AaSOR- und TpSOR-Kryo-EM-Strukturen wurden mit Auflösungen von 2,5 bzw. 3.1 Å aufgeklärt und legen nahe, dass in der Kavität ein zweites Metall gebunden sein könnte. Zusätzliche Elektronendichten an zwei semi-essentiellen active site pocket Cysteinen in der AaSOR-Kryo-EM-Struktur deuten darüber hinaus auf mechanistisch notwendige Schwefel-Polymerisierungs- und/oder -Depolymerisierungsreaktionen hin.

Der Vergleich von SORs und PDOs zeigte, dass sich deren Strukturen und Reaktionsmechanismen fundamental unterscheiden, obwohl beide mononukleare Eisenzentren besitzen und Sulfanschwefel mit Sauerstoff oxidieren. Die Tv. paradoxus Proteomanalyse verdeutlichte darüber hinaus, dass die SOR auch im dissimilatorischen Schwefelstoffwechsel mesophiler Bakterien genutzt wird, während die in vivo-Rolle der PDOs in chemolithoautotrophen Bakterien weniger klar ist: Möglicherweise sind sie wichtiger für die Redox-Balance im Cytoplasma als für die oxidative Energiekonversation.

Item Type: Ph.D. Thesis
Erschienen: 2020
Creators: Rühl, Patrick
Title: Schwefel und Persulfid (Di-) Oxygenasen: Biochemische, spektroskopische und strukturelle Eigenschaften und deren Einfluss auf die Reaktionsmechanismen
Language: German
Abstract:

Als Schwefel (Di-)Oxygenasen waren ursprünglich zwei Enzymklassen beschrieben worden, die elementaren Schwefel (S0) mit Sauerstoff (O2) oxidieren. Sie gehören zu der sehr viel größeren Gruppe sogenannter „Schwefel-oxidierender Enzyme“, unter denen alle Enzyme zusammengefasst sind, die reduzierte Schwefelverbindungen oxidieren. Die hier untersuchten Schwefel Oxygenasen Reduktasen (SORs) und Persulfid Dioxygenasen (PDOs) ähneln sich darin, dass sie mononukleare nicht-Häm Eisenatome besitzen, welche die S0- bzw. Persulfid-Oxidation mit O2 in den jeweiligen aktiven Zentren katalysieren. Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel, Vertreter beider nicht verwandter Enzymklassen auf molekularer und struktureller Ebene im Detail zu charakterisieren, um Rückschlüsse auf generelle Funktionsweisen und die Reaktionsmechanismen zu erhalten.

PDOs kommen in der Natur ubiquitär vor und katalysieren die sauerstoffabhängige Oxidation des Sulfanschwefels von Glutathionpersulfid (GSSH), das aus reduziertem Glutathion (GSH) durch Sulfanschwefel-Transferasen oder auch spontan mit S0 entsteht. Reaktionsprodukte der PDOs sind Sulfit und GSH. Das pdo-Gen aus Acidithiobacillus caldus (AcPDO) wurde heterolog in E. coli exprimiert, mit durchschnittlichen Proteinausbeuten von ≈ 27,9 mg/l LB-Medium. Der mittlere Eisengehalt der rekombinanten Proteine betrug 0,77 nmol Fe/nmol Protein bei einer Enzymaktivität von 61,0 U/mg Protein bei 40 °C und pH 7,5. Enzymtests mit steigenden GSH-Konzentrationen und S0 als Co-Substrat resultierten in einer Michaelis-Menten-Kinetik mit KM und Kcat von 0,5 mM und 181 s-1, wohingegen steigende GSSH-Konzentrationen einen sigmoidalen Kurvenverlauf mit einem Hill-Koeffizienten von 2,3 zur Folge hatte, was auf positive Kooperativität der Enzymuntereinheiten hindeutet. Die AcPDO-Röntgenkristallstruktur wurde mit einer Auflösung von 2,07 Å aufgeklärt, deren asymmetrische Einheit aus einem Homodimer besteht. Die Kristallpackung der Einheitszelle und Gelfiltration legen eine Tetramerisierung nahe, welche über Oberflächenladungen und hydrophobe Interaktionen vermittelt wird. Das katalytische high-spin Eisenatom wird in einer 2-His-1-Carboxylat-Triade ligiert und besitzt ein Reduktionspotential E0‘ von -234 mV. Spektroskopische Analysen zeigten charakteristische Ladungstransfer-Spezies nach Inkubation mit GSSH, welche auf Fe-O2 und Fe-O2-SSR-Intermediate zurückzuführen sind und legten die Bildung eines Fe(IV)-Reaktionsintermediates nahe. In einer ersten, umfassenden PDO-Mutagenese-Studie wurden insgesamt zehn funktional wichtige Aminosäuren identifiziert, von denen D61, H62 und H171 konserviert und essentiell sind. Sie befinden sich in zwei active site loops in unmittelbarer Nähe zum Eisenzentrum und sind vermutlich über Säure-Base-katalysiertes Protonen-Shuffling direkt an der homolytischen Spaltung eines zyklischen Peroxo-Reaktionsintermediates beteiligt. Substratbindungsanalysen gaben einen KD-Wert von 113 µM für die GSSH Bindung an, wobei eine Alanin-Variante des in der Substratbindungstasche befindlichen R139 einen starken Abfall der Enzymaktivität bewirkte und nicht mehr in der Lage war, Substrat zu binden. Oberflächen-Cysteine befinden sich in beachtlichen Abstand zum aktiven Zentrum (>16 Å) und bilden in der AcPDO-3D-Struktur eine Disulfidbrücke aus. Gel-Shift-Assays zeigten, dass es sich um ein redoxaktives Zentrum handelt. Die Disulfidbrücke stabilisiert eine α-Helix und koordiniert über N221 die Position von D61 und H62. Alanin-Varianten der beiden Cysteine besaßen verbleibende Enzymaktivitäten von <2 % und zeigten nach GS(S)H-Inkubation massenspektrometrisch eine Glutathionylierung am jeweils verbleibenden Cystein. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Protein-S-Glutathionylierung als Schutzmechanismus gegen unkontrollierte Thiol-Oxidation und dem damit verbundenen Verlust der Enzymaktivität fungiert.

SORs katalysieren eine sauerstoffabhängige Disproportionierungsreaktion von S0 mit Sulfit und Sulfid als Reaktionsprodukte. Normalerweise besitzen SORs Produktstöchiometrien zwischen 4:1 und 10:1, wobei Oxygenase- und Reduktase-Aktivitäten bislang nicht voneinander getrennt werden konnten. Sequenzvergleiche zeigten, dass die SOR aus dem mesophilen Bakterium Thioalkalivibrio paradoxus ARh1 (TpSOR) tief in SOR-Dendrogrammen abzweigt. SWATH-LC/MS/MS-Analysen zeigten, dass die TpSOR – im Gegensatz zu PDOs – in großen Mengen in Kulturen mit Thiosulfat bzw. Thiocyanat als Energiequelle gebildet wird. Sie scheint, zusammen mit revers arbeitender Sulfitreduktase, Adenylylsulfatreduktase und periplasmatischen Flavocytochromen c, eine zentrale Rolle im oxidativen Schwefelmetabolismus von Tv. paradoxus einzunehmen, wobei deren Abundanz eng mit dem Auf- und Abbau intrazellulärer Schwefelkugeln korreliert. Die TpSOR wurde rekombinant in E. coli produziert, mit durchschnittlichen Proteinausbeuten von ≈ 30,9 mg/l LB-Medium. Die mittlere Oxygenase-Aktivität betrug 323 U/mg Protein bei 80 °C und pH 9. Der Schmelzpunkt der TpSOR wurde bei 81 °C ermittelt und befindet sich damit nahe des Temperaturoptimums. Die TpSOR-Reduktase-Aktivität betrug in kolorimetrischen Quantifizierungen der Reaktionsprodukte maximal 0,03 U/mg Protein, was < 1 % im Vergleich zu allen anderen SORs und einem Oxygenase/Reduktase-Verhältnis von ≈ 10 000:1 entspricht. Um reproduzierbare Produktstöchiometrien in SORs zu ermitteln, wurde ein HPLC-gekoppelter SOR-Enzymtest entwickelt. Quantifizierungen der Reaktionsprodukte resultieren in Produktverhältnissen von 30:1 für die TpSOR, wohingegen SORs aus dem hyperthermophilen Archaeon Acidianus ambivalens (AaSOR) und dem mesophilen Bakterium Halo-thiobacillus neapolitanus für die S0-Disproportionierungsreaktion erwartete Verhältnisse von nahezu 1:1 aufwiesen. Dementsprechend scheint die TpSOR eine Schwefel Oxygenase mit einer untypisch geringen Reduktase-Aktivität darzustellen. Die TpSOR-Röntgenkristallstruktur wurde mit einer Auflösung von 2,84 Å aufgeklärt und zeigte einen SOR-typischen Aufbau. Das mononukleare Eisenzentrum befindet sich in einer deformierten oktaedrischen Koordinationssphäre mit einem Reduktionspotential E0‘ von -252 mV und liegt, im Unterschied zur AaSOR, nach Katalyse oxidiert vor. Unterschiede im Vergleich zu anderen SORs ergeben sich in der Konstitution der active site pocket, welche in der TpSOR durch einen interhelikalen loop unterbrochen ist. Die verkleinerte Bindungstasche schließt lediglich das für die Reaktion essentielle C44 ein und könnte Reaktionsprodukte oder -intermediate vor chemischer Oxidation/Reduktion schützen. Darüber hinaus wurde in allen drei SORs mittels Software-gestützten Tunnelanalysen ein zuvor unbekannter Zugang zum aktiven Zentrum identifiziert, welcher über das essentielle Cystein eine zweite Kavität mit der ative site pocket verbindet. AaSOR- und TpSOR-Kryo-EM-Strukturen wurden mit Auflösungen von 2,5 bzw. 3.1 Å aufgeklärt und legen nahe, dass in der Kavität ein zweites Metall gebunden sein könnte. Zusätzliche Elektronendichten an zwei semi-essentiellen active site pocket Cysteinen in der AaSOR-Kryo-EM-Struktur deuten darüber hinaus auf mechanistisch notwendige Schwefel-Polymerisierungs- und/oder -Depolymerisierungsreaktionen hin.

Der Vergleich von SORs und PDOs zeigte, dass sich deren Strukturen und Reaktionsmechanismen fundamental unterscheiden, obwohl beide mononukleare Eisenzentren besitzen und Sulfanschwefel mit Sauerstoff oxidieren. Die Tv. paradoxus Proteomanalyse verdeutlichte darüber hinaus, dass die SOR auch im dissimilatorischen Schwefelstoffwechsel mesophiler Bakterien genutzt wird, während die in vivo-Rolle der PDOs in chemolithoautotrophen Bakterien weniger klar ist: Möglicherweise sind sie wichtiger für die Redox-Balance im Cytoplasma als für die oxidative Energiekonversation.

Place of Publication: Darmstadt
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Microbiology and Archaea
10 Department of Biology > Sulfur Biochemistry and Microbial Bioenergetics
Date Deposited: 22 Jul 2020 09:12
DOI: 10.25534/tuprints-00011493
Official URL: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/11493
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-114938
Referees: Kletzin, PD Dr. Arnulf and Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas
Refereed / Verteidigung / mdl. Prüfung: 26 June 2020
Alternative Abstract:
Alternative abstract Language
Initially, two classes of enzymes were described as sulfur (di-)oxygenases, which oxidize elementary sulfur (S0) with oxygen (O2). They belong to the much larger group of so-called "sulfur-oxidizing enzymes", which includes all enzymes that oxidize reduced sulfur compounds. The sulfur oxygenase reductases (SORs) and persulfide dioxygenases (PDOs) studied here are similar in possessing mononuclear non-heme iron atoms, which catalyze the S0 or persulfide oxidation with O2 at the respective active sites. The aim of this study was the characterization of representatives from both unrelated enzyme classes on a molecular and structural level in order to draw conclusions on general modes of function and reaction mechanisms. PDOs occur ubiquitously in nature and catalyze the oxygen-dependent oxidation of the sulfane sulfur of glutathione persulfide (GSSH), which is formed from reduced glutathione (GSH) by sulfane sulfur transferases or spontaneously with S0. Reaction products of the PDOs are sulfite and GSH. The pdo gene from Acidithiobacillus caldus (AcPDO) was heterologously expressed in E. coli with average protein yields of ≈ 27.9 mg/l LB medium. The mean iron content of the recombinant proteins was 0.77 nmol Fe/nmol protein with enzyme activity of 61.0 U/mg protein at 40 °C and pH 7.5. Enzyme assays with increasing GSH concentrations and S0 as co-substrate resulted in a Michaelis-Menten kinetics with KM and Kcat of 0.5 mM and 181 s-1, whereas increasing GSSH concentrations resulted in a sigmoidal curve with a Hill coefficient of 2.3, indicating positive cooperativity of the enzyme subunits. The AcPDO X-ray crystal structure was solved with a resolution of 2.07 Å with an asymmetric unit consisting of a homodimer. The crystal packing of the unit cell and gel filtration suggests tetramerization, which is mediated by surface charges and hydrophobic interactions. The catalytic high-spin iron atom is ligated in a 2-his-1-carboxylate triad and has a reduction potential E0' of -234 mV. Spectroscopic analyses showed characteristic charge transfer species after incubation with GSSH, which are due to Fe-O2 and Fe-O2-SSR intermediates and indicated the formation of an Fe(IV) reaction intermediate. In a first comprehensive PDO mutagenesis study, a total of ten functionally important amino acids were identified, of which D61, H62 and H171 are conserved and essential. They are located in two active site loops in close proximity to the iron site and are presumably directly involved in the homolytic cleavage of a cyclic peroxo reaction intermediate via acid-base-catalyzed proton shuffling. Substrate binding analyses indicated a KD value of 113 μM for GSSH binding, however an alanine variant of R139 in the substrate binding pocket caused a sharp drop in enzyme activity and was no longer able to bind substrate. Surface cysteines are located at a considerable distance from the active site (>16 Å) and form a disulfide bridge in the AcPDO 3D structure. Gel shift assays indicated that this represents a redox-active center. The disulfide bridge stabilizes an α-helix and coordinates the position of D61 and H62 via N221. Alanine variants of the two cysteines had remaining enzyme activities of <2 % and showed glutathionylation on the remaining cysteine after GS(S)H incubation by mass spectrometry. The results suggest that protein S glutathionylation acts as a protective mechanism against uncontrolled thiol oxidation and the associated loss of enzyme activity. SORs catalyze an oxygen-dependent disproportionation reaction of S0 with sulfite and sulfide as reaction products. Typically, SORs have product stoichiometries between 4:1 and 10:1, whereas oxygenase and reductase activities could not be separated so far. Sequence comparisons showed that the SOR from the mesophilic bacterium Thioalkalivibrio paradoxus ARh1 (TpSOR) branches deeply in SOR dendrograms. SWATH LC/MS/MS analyses showed that the TpSOR - in contrast to PDOs - is produced in large amounts in cultures containing thiosulfate or thiocyanate as energy source. Together with reverse-working sulfite reductase, adenylyl sulfate reductase and periplasmatic flavocytochromes c, the TpSOR appears to play a central role in the oxidative sulfur metabolism of Tv. paradoxus, whereby its abundance correlates closely with the formation and degradation of intracellular sulfur globules. TpSOR was produced recombinantly in E. coli with average protein yields of ≈ 30.9 mg/l LB medium. The mean oxygenase activity was 323 U/mg protein at 80 °C and pH 9. The melting point of TpSOR was determined at 81 °C, which is close to the temperature optimum. The TpSOR reductase activity was maximum 0.03 U/mg protein in colorimetric quantifications of the reaction products, which corresponds to < 1% compared to all other SORs and an oxygenase/reductase ratio of ≈ 10 000:1. To determine reproducible product stoichiometries in SORs, an HPLC coupled SOR enzyme assay was developed. Quantifications of the reaction products resulted in product ratios of 30:1 for the TpSOR, whereas SORs from the hyperthermophilic Archaeon Acidianus ambivalens (AaSOR) and the mesophilic bacterium Halothiobacillus neapolitanus showed expected ratios of almost 1:1 for the S0 disproportionation reaction. Consequently, the TpSOR appears to be a sulfur oxygenase with an atypically low reductase activity. The TpSOR X-ray crystal structure was solved with a resolution of 2.84 Å and showed an overall structure typical for SORs. The mononuclear iron center is located in a deformed octahedral coordination sphere with a reduction potential E0' of -252 mV and is oxidized after catalysis, which differs from AaSOR. In contrast to other SORs, differences are also found in the constitution of the active site pocket, which is interrupted in the TpSOR by an interhelical loop. The reduced binding pocket includes only C44, which is essential for enzyme activity, and could protect reaction products or intermediates from chemical oxidation/reduction. Furthermore, in all three SORs a previously unknown access to the active site was identified by software supported tunnel analysis, which connects a second cavity with the active site pocket through the essential cysteine. AaSOR and TpSOR cryo-EM structures were solved with resolutions of 2.5 and 3.1 Å, respectively, suggesting the binding of a second metal in this cavity. Moreover, additional electron densities at two semi-essential active site pocket cysteines in the AaSOR cryo-EM structure point to mechanistically necessary sulfur polymerization and/or depolymerization reactions. The comparison of SORs and PDOs showed that their structures and reaction mechanisms are fundamentally different, although both have mononuclear iron centers and oxidize sulfane sulfur with oxygen. The Tv. paradoxus proteome analysis also revealed that the SOR is involved in the dissimilatory sulfur metabolism of mesophilic bacteria, whereas the in vivo role of PDOs in chemolithoautotrophic bacteria is less clear: they might be more important for the redox balance in the cytoplasm than for oxidative energy conversation.English
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