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Charakterisierung von Zellwandproteinen des Transglutaminase-Produzenten Streptomyces mobaraensis

Anderl, Anita (2020)
Charakterisierung von Zellwandproteinen des Transglutaminase-Produzenten Streptomyces mobaraensis.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.25534/tuprints-00011585
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

Streptomyceten sind Gram-positive Eubakterien mit einem ausgeprägten Sekundärmetabolismus, die für das Wachstum Nährstoffe durch Zersetzung vorhandener Makromoleküle in Boden und Gewässern gewinnen. Dabei durchlaufen sie komplexe Differenzierungsphasen, in denen nährstoffanreicherndes Substrat- und reproduktives Luftmycel, das mit der Sporenbildung endet, entstehen. Streptomyces mobaraensis unterscheidet sich von anderen Streptomyceten durch die Produktion des Proteinvernetzungsenzyms Transglutaminase, dessen physiologische Funktion noch wenig untersucht ist. Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung amphiphiler Oberflächenproteine der Lufthyphen und Sporen von S. mobaraensis, bezeichnet als Chapline und Rodline, sowie ihre Interaktion mit Transglutaminase. Dazu wurde zunächst für das lange Chaplin 1 (Sm-Chp1) und Rodlin 1 (Sm-Rdl1), als Vertreter der zwei Proteinklassen, ein effektives Produktionsverfahren zur Herstellung in E. coli etabliert. Untersuchungen mittels CD- und Fluoreszenzspektroskopie zeigten, dass beide Proteine eine ungeordnete Struktur in Lösung besitzen, die sich bei erhöhter Exposition an der Luft/Wasser-Grenzfläche in eine β-Faltblatt-reiche, amyloide Struktur umwandelt. Sm-Chp1 als auch Sm-Rdl1 bilden einen stabilen Proteinfilm an der Luft/Wasser-Grenzfläche aus und besitzen eine hohe Oberflächenaktivität, wie durch Experimente mit einem Langmuir-Trog nachgewiesen wurde. Über den enzymatischen Einbau von Monobiotinylcadaverin wurden beide Proteine in Lösung als Glutamindonor-Substrate der Transglutaminase identifiziert. Besonders Sm-Chp1 erwies sich als ein exzellentes Substrat im Vergleich mit bisher untersuchten Glutamindonor-Substraten von S. mobaraensis, was auch auf die ungeordnete Struktur von Sm-Chp1 zurückgeführt wurde. Der Austausch einzelner Glutamine gegen Asparagin über ortsgerichtete Mutagenese zeigte, dass Glutamine innerhalb der Chaplin-Domänen modifiziert wurden. Unter der Annahme, dass deren Zugänglichkeit im gefalteten Zustand von Sm-Chp1 eingeschränkt sein sollte, wurden erste Versuche unternommen, über die druck-induzierte Assemblierung von Sm-Chp1 an der Luft/Wasser-Grenzfläche im Langmuir-Trog die natürliche Faltung zu simulieren. Nach dem Transfer der Sm-Chp1-Filme auf eine hydrophobe Membran erfolgte die Transglutaminase-vermittelte Biotinylierung, welche noch nicht zu einem zweifelsfreien Ergebnis führte. Weiterhin wurde für Sm-Chp1 mittels biochemischer Methoden Metallbindungseigenschaften für Nickel, Zink und Kupfer nachgewiesen. Diese wurden dabei auf ausgedehnte Histidin-reiche Domänen zurückgeführt, durch die sich Sm-Chp1 von Sc-ChpC aus S. coelicolor A3(2) unterscheidet. Isothermale Titrationskalorimetrie und andere Methoden legten eine Bindekapazität von sieben bis acht Metallionen und Dissoziationskonstanten im mikromolaren Bereich für Nickel und Zink nahe. Damit gehört Sm-Chp1 zu den noch wenig charakterisierten Proteinen, die sich an der Versorgung von Enzymen mit essentiellen Metallen beteiligen und deren Proteinstruktur an den Metallbindestellen wegen der hohen Flexibilität von Histidin-reichen Domänen unbekannt ist. In einem Nebenprojekt erfolgte die Charakterisierung einer Sortase der Klasse E aus S. mobaraensis, der Sm-SrtE2, wofür zunächst ein Produktionsverfahren für die Herstellung in E. coli etabliert wurde. Das Enzym wies eine geringe Stabilität auf, welche vermutlich durch Entfernung des N-terminalen Membranankers entstand. Die im Vergleich mit anderen Proteinen aus S. mobaraensis niedrige Temperaturresistenz spricht für eine stabilisierende Funktion dieser Domäne. Der Nachweis der Aktivität, welche unabhängig von Metallionen ist, erfolgte durch die Spaltung von FRET-Pentapeptiden, die putative Sortaseerkennungsmotive beinhalteten. Das Pentapeptid LAETG war das bevorzugte Substrat der Sm-SrtE2. Die Transpeptidierungsaktivität wurde zusätzlich durch Fluoreszenzmarkierung des intrinsischen Substratproteins Sm-Chp1 mit dem Motiv LAHTG nachgewiesen. Dabei erwies sich Sm-Chp1 als ein besseres Substrat im Vergleich mit Sc-ChpC von S. coelicolor, welches das Sortaseerkennungsmotiv LAETG besitzt. Die Effizienz der Sm-SrtE2 ist offensichtlich auch von der Struktur des Substratproteins und weiteren Aminosäuren abhängig, die das Sortaseerkennungsmotiv flankieren. Die Transglutaminase-vermittelte Biotinylierung der N-terminalen Glutamine resultierte vermutlich aus der Einkürzung der Sm-SrtE2, was einen unstrukturierten, flexiblen N-Terminus ergab. Durch die N-terminale Verankerung des Enzyms in der Membran sollte Transglutaminase in vivo keine Wechselwirkung mit Sm-SrtE2 eingehen können.

Typ des Eintrags: Dissertation
Erschienen: 2020
Autor(en): Anderl, Anita
Art des Eintrags: Erstveröffentlichung
Titel: Charakterisierung von Zellwandproteinen des Transglutaminase-Produzenten Streptomyces mobaraensis
Sprache: Deutsch
Referenten: Kolmar, Prof. Dr. Harald ; Fuchsbauer, Prof. Dr. Hans-Lothar
Publikationsjahr: 2020
Ort: Darmstadt
Datum der mündlichen Prüfung: 5 März 2020
DOI: 10.25534/tuprints-00011585
URL / URN: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/11585
Kurzbeschreibung (Abstract):

Streptomyceten sind Gram-positive Eubakterien mit einem ausgeprägten Sekundärmetabolismus, die für das Wachstum Nährstoffe durch Zersetzung vorhandener Makromoleküle in Boden und Gewässern gewinnen. Dabei durchlaufen sie komplexe Differenzierungsphasen, in denen nährstoffanreicherndes Substrat- und reproduktives Luftmycel, das mit der Sporenbildung endet, entstehen. Streptomyces mobaraensis unterscheidet sich von anderen Streptomyceten durch die Produktion des Proteinvernetzungsenzyms Transglutaminase, dessen physiologische Funktion noch wenig untersucht ist. Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung amphiphiler Oberflächenproteine der Lufthyphen und Sporen von S. mobaraensis, bezeichnet als Chapline und Rodline, sowie ihre Interaktion mit Transglutaminase. Dazu wurde zunächst für das lange Chaplin 1 (Sm-Chp1) und Rodlin 1 (Sm-Rdl1), als Vertreter der zwei Proteinklassen, ein effektives Produktionsverfahren zur Herstellung in E. coli etabliert. Untersuchungen mittels CD- und Fluoreszenzspektroskopie zeigten, dass beide Proteine eine ungeordnete Struktur in Lösung besitzen, die sich bei erhöhter Exposition an der Luft/Wasser-Grenzfläche in eine β-Faltblatt-reiche, amyloide Struktur umwandelt. Sm-Chp1 als auch Sm-Rdl1 bilden einen stabilen Proteinfilm an der Luft/Wasser-Grenzfläche aus und besitzen eine hohe Oberflächenaktivität, wie durch Experimente mit einem Langmuir-Trog nachgewiesen wurde. Über den enzymatischen Einbau von Monobiotinylcadaverin wurden beide Proteine in Lösung als Glutamindonor-Substrate der Transglutaminase identifiziert. Besonders Sm-Chp1 erwies sich als ein exzellentes Substrat im Vergleich mit bisher untersuchten Glutamindonor-Substraten von S. mobaraensis, was auch auf die ungeordnete Struktur von Sm-Chp1 zurückgeführt wurde. Der Austausch einzelner Glutamine gegen Asparagin über ortsgerichtete Mutagenese zeigte, dass Glutamine innerhalb der Chaplin-Domänen modifiziert wurden. Unter der Annahme, dass deren Zugänglichkeit im gefalteten Zustand von Sm-Chp1 eingeschränkt sein sollte, wurden erste Versuche unternommen, über die druck-induzierte Assemblierung von Sm-Chp1 an der Luft/Wasser-Grenzfläche im Langmuir-Trog die natürliche Faltung zu simulieren. Nach dem Transfer der Sm-Chp1-Filme auf eine hydrophobe Membran erfolgte die Transglutaminase-vermittelte Biotinylierung, welche noch nicht zu einem zweifelsfreien Ergebnis führte. Weiterhin wurde für Sm-Chp1 mittels biochemischer Methoden Metallbindungseigenschaften für Nickel, Zink und Kupfer nachgewiesen. Diese wurden dabei auf ausgedehnte Histidin-reiche Domänen zurückgeführt, durch die sich Sm-Chp1 von Sc-ChpC aus S. coelicolor A3(2) unterscheidet. Isothermale Titrationskalorimetrie und andere Methoden legten eine Bindekapazität von sieben bis acht Metallionen und Dissoziationskonstanten im mikromolaren Bereich für Nickel und Zink nahe. Damit gehört Sm-Chp1 zu den noch wenig charakterisierten Proteinen, die sich an der Versorgung von Enzymen mit essentiellen Metallen beteiligen und deren Proteinstruktur an den Metallbindestellen wegen der hohen Flexibilität von Histidin-reichen Domänen unbekannt ist. In einem Nebenprojekt erfolgte die Charakterisierung einer Sortase der Klasse E aus S. mobaraensis, der Sm-SrtE2, wofür zunächst ein Produktionsverfahren für die Herstellung in E. coli etabliert wurde. Das Enzym wies eine geringe Stabilität auf, welche vermutlich durch Entfernung des N-terminalen Membranankers entstand. Die im Vergleich mit anderen Proteinen aus S. mobaraensis niedrige Temperaturresistenz spricht für eine stabilisierende Funktion dieser Domäne. Der Nachweis der Aktivität, welche unabhängig von Metallionen ist, erfolgte durch die Spaltung von FRET-Pentapeptiden, die putative Sortaseerkennungsmotive beinhalteten. Das Pentapeptid LAETG war das bevorzugte Substrat der Sm-SrtE2. Die Transpeptidierungsaktivität wurde zusätzlich durch Fluoreszenzmarkierung des intrinsischen Substratproteins Sm-Chp1 mit dem Motiv LAHTG nachgewiesen. Dabei erwies sich Sm-Chp1 als ein besseres Substrat im Vergleich mit Sc-ChpC von S. coelicolor, welches das Sortaseerkennungsmotiv LAETG besitzt. Die Effizienz der Sm-SrtE2 ist offensichtlich auch von der Struktur des Substratproteins und weiteren Aminosäuren abhängig, die das Sortaseerkennungsmotiv flankieren. Die Transglutaminase-vermittelte Biotinylierung der N-terminalen Glutamine resultierte vermutlich aus der Einkürzung der Sm-SrtE2, was einen unstrukturierten, flexiblen N-Terminus ergab. Durch die N-terminale Verankerung des Enzyms in der Membran sollte Transglutaminase in vivo keine Wechselwirkung mit Sm-SrtE2 eingehen können.

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Streptomycetes are Gram-positive eubacteria with a remarkable secondary metabolism that obtain nutrients for growth by decomposing available macromolecules in soil and water. The multicellular growth results in a widely branched, nutrient-rich vegetative mycelium which is exploited in the reproductive phase to form aerial hyphae and spores. Streptomyces mobaraensis differs from other streptomycetes in the production of the protein cross-linking enzyme transglutaminase, whose physiological function remains to be determined. Subject of the present work was the characterization of amphiphilic surface proteins referred to as chaplins and rodlins that cover aerial hyphae and spores of S. mobaraensis. Furthermore, their interaction with transglutaminase was investigated. To this end, an effective production procedure was established in E. coli for the long chaplin 1 (Sm-Chp1) and rodlin 1 (Sm-Rdl1) as representatives of both protein types. Using CD and fluorescence spectroscopy both proteins were found to have a disordered structure in solution which changes into a β-sheet-rich amyloid structure upon increased exposure at the air/water interface. Sm-Chp1 as well as Sm-Rdl1 form stable protein films at the air/water interface and have a high surface activity as demonstrated by experiments with a Langmuir trough. Enzymatic incorporation of monobiotinylcadaverine revealed that both proteins are glutamine donor substrates of transglutaminase in solution. Sm-Chp1 proved to be an excellent substrate compared to previously studied glutamine donor substrates of S. mobaraensis which was also attributed to the disordered structure of Sm-Chp1. Substitution of individual glutamines for asparagine via site-directed mutagenesis showed that the most accessible glutamines are near the sortase binding motif but glutamines of the chaplin domains were also weakly modified by transglutaminase. Assuming restricted accessibility in the folded state of Sm-Chp1, first attempts were made to simulate the physiological folding by pressure-induced assembly of Sm-Chp1 at the air/water interface using the Langmuir trough. After the transfer of Sm-Chp1 films onto a hydrophobic membrane transglutaminase-mediated biotinylation was performed leading to yet inconsistent results. Furthermore, metal binding properties of Sm-Chp1 for nickel, zinc and copper were determined using biochemical methods. The acquisition of heavy metals was attributed to extensive histidine-rich domains that distinguish Sm-Chp1 from Sc-ChpC from S. coelicolor A3(2). Isothermal titration calorimetry and other methods determined a binding capacity of seven to eight metal ions and dissociation constants in the micromolar range for nickel and zinc. Thus, Sm-Chp1 belongs to the still barely characterized proteins that participate in the supply of essential metals to enzymes and whose protein structure at the metal binding sites is unknown due to the high flexibility of histidine-rich domains. In a side project, a class E sortase from S. mobaraensis, Sm-SrtE2, was characterized. To this end, a production procedure in E. coli was established. The enzyme showed low stability which was probably caused by the removal of the N-terminal membrane anchor. The low temperature resistance compared to other proteins from S. mobaraensis suggests a stabilizing function of this domain. The activity, which is independent of metal ions, was detected by cleavage of FRET pentapeptides including putative sortase recognition motifs. The pentapeptide LAETG was the preferred substrate of Sm-SrtE2. The transpeptidation activity was additionally determined by fluorescent labeling of the intrinsic substrate protein Sm-Chp1 endowed with the sequence motif LAHTG. Sm-Chp1 proved to be a better substrate compared to Sc-ChpC from S. coelicolor, which has the sortase recognition motif LAETG. The efficiency of Sm-SrtE2 is obviously also dependent on the structure of the substrate protein and other amino acids flanking the sortase recognition motif. The transglutaminase-mediated biotinylation of the N-terminal glutamines probably resulted from the shortening of Sm-SrtE2 and a disordered, flexible N-terminus. Due to the N-terminal anchoring of the enzyme in the membrane, transglutaminase should not be able to interact with Sm-SrtE2 in vivo.

Englisch
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-115854
Sachgruppe der Dewey Dezimalklassifikatin (DDC): 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Fachbereich(e)/-gebiet(e): 07 Fachbereich Chemie
07 Fachbereich Chemie > Clemens-Schöpf-Institut > Fachgebiet Biochemie
07 Fachbereich Chemie > Clemens-Schöpf-Institut > Fachgebiet Biochemie > Allgemeine Biochemie
Hinterlegungsdatum: 18 Jun 2020 09:17
Letzte Änderung: 23 Jun 2020 05:14
PPN:
Referenten: Kolmar, Prof. Dr. Harald ; Fuchsbauer, Prof. Dr. Hans-Lothar
Datum der mündlichen Prüfung / Verteidigung / mdl. Prüfung: 5 März 2020
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