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Evaluation of Yeast Display Fab Libraries Derived from Tumor Infiltrating B Cells

Sapir, Ashi (2020):
Evaluation of Yeast Display Fab Libraries Derived from Tumor Infiltrating B Cells.
Darmstadt, Technische Universität, DOI: 10.25534/tuprints-00011371,
[Online-Edition: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/11371],
[Ph.D. Thesis]

Abstract

Seit ihrer erstmaligen klinischen Zulassung für die Krebsbehandlung Ende der 1990er gelten monoklonale Antikörper (mAbs) als einer der erfolgreichsten und vielversprechendsten Behandlungsansätze in der Onkologie. mAbs, die gezielt auf tumorassoziierte Antigene (TAA) einwirken, und seit neuerem mAbs, welche die durch Checkpoints vermittelte Hemmung der T-Zell-Tumorantwort verhindern, haben sich als hinsichtlich der Tumorremission bei Krebspatienten wirksam erwiesen (Carter and Lazar, 2018). Dennoch gibt es auch in der Entwicklung von mAbs für die Krebsbehandlung Grenzen und viele mAbs kommen aufgrund der niedrigen Zulassungsrate nicht in der klinischen Praxis zur Anwendung (Nelson and Reichert, 2009; Workman et al., 2017). Nach mehr als 20 Jahren der Entwicklung gibt es noch immer relativ wenige tumorassoziierte Antigene (TAA) als Targets für die mAbs-Therapie, die für die klinische Therapie zugelassen sind. Daher müssen neue Ansätze und Strategien im Prozess der Selektion von mAbs gefunden werden, die zur Ermittlung neuer TAA bzw. besserer, neuartiger mAbs für die Krebstherapie führen können (Sánchez-Martín et al., 2015). Zahlreiche Publikationen haben in den letzten Jahren gezeigt, dass das Vorliegen von tumorinfiltrierenden B-Zellen (TIL-B) in den Tumoren eines Patienten mit einem positiven Prognoseeffekt verbunden ist (Wouters and Nelson, 2018). Mehrere Veröffentlichungen deuten zudem darauf hin, dass TIL-B aus Patientengewebe eine reichhaltige Quelle für tumorbindende Antikörper sein können (Pavoni et al., 2007; Novinger, Ashikaga and Krag, 2015). In der hier vorgestellten Studie wurden – soweit uns bekannt erstmalig – TIL-B-Antikörper-Repertoires von 8 Patienten mit kolorektalem Karzinom genutzt, um 2 Hefe-Fab-Oberflächendisplay-Bibliotheken (κ und λ) zu erstellen. Die Evaluierung der Bibliotheken anhand von Durchflusszytometrie-Screening im Hinblick auf eine Vielzahl von TAA- und Immun-Checkpoint-Molekülen führte zur Ermittlung mehrerer potenzieller Bindungspartner für diese Screeningtargets. Danach erfolgte anhand von Durchflusszytometrie eine Sortierung im Hinblick auf 4 Targets: CEACAM5, LRP6, LAG3 und OX40L. Dies erlaubte die Selektion spezifischer, aber niedrig-affiner humaner Antikörper für diese Targets. Die weitere Evaluierung der Bibliotheken umfasste einen neuartigen Ansatz: Dabei erfolgte ein phänotypisches Screening mithilfe einer Hefedisplay-Biopanning-Plattform gegen entsprechende aus kolorektalen Karzinomen abgeleitete Zelllinien (HCT 116, HT-29 und SW620). Eine hohe Anreicherung der Hefe-Fab-Oberflächendisplay-Bindungspartner an den aus kolorektalen Karzinomen abgeleiteten Zellen ließ sich innerhalb von nur 3 Runden Biopanning beobachten. Mithilfe des Biopanning-Verfahrens isolierte Antikörper (HCT 116, HT-29) zeigten eine selektive Bindung an ähnlichen Epitopen wie sie auf der Zelloberfläche von HCT116- und HT-29-Zellen vorhanden sind, da diese Antikörper dieselbe schwere Kette aufwiesen, obwohl sie aus zwei unterschiedlichen Zelllinien selektiert wurden. Die unterschiedlichen leichten Ketten der isolierten Antikörper hatten nachweislich Einfluss auf ihre Affinität. Die weitere Charakterisierung eines der isolierten Antikörper (TILB-HCT116-B24) ergab einen EC50-Wert von 569 nM bei Bindung an HCT116. Ein Zellbindungsassay anhand von Fluoreszenzmikroskopie mit diesem Antikörper an HCT 116-Zellen und normalen Fibroblastenzellen aus dem Colon (CCD-18Co) belegte die spezifische Bindung an HCT 116-Zellen. Soweit uns bekannt ist, ist dies die erste Studie, in der Next-Generation Sequencing (NGS) als Hochdurchsatz-Sequenzierung für die aus den TIL-B-Zellen der einzelnen Patienten abgeleiteten Klone im Hinblick auf die Fab-Hefeoberflächendisplay-Bibliotheken und die Klone aus der Biopanning-Anreicherung eingesetzt wurde. Diese NGS-Daten, die auf der klonalen Frequenzanalyse der schweren und leichten Kettensequenzen jedes Patienten basieren, können einen Hinweis auf die klonale Expansion von TIL-B geben, die im Tumor der Patienten auftritt. Zudem führte die Kombination von Hochdurchsatz-Sequenzierung und Hefe-Display-Biopanning-Screening zu einer ähnlich selektiven Anreicherung, wie wenn Biopanning der Hefe-Bibliothek gegen die aus kolorektalen Karzinomen abgeleiteten Zelllinien HCT 116 und HT-29 erfolgte. Hierbei fiel das Biopanning-Ergebnis gegen die aus kolorektalen Karzinomen abgeleitete SW620-Zelllinie anders aus: Es ergab andere Klone, was auf eine hochspezifische Selektion mithilfe des Biopanning-Prozesses schließen lässt. So unterstützt die vorgestellte Studie die Hypothese, dass aus TIL-B abgeleitete Bibliotheken ein Antikörper-Repertoire enthalten, das vorzugsweise an Krebszellen bindet. Die Hefeoberflächendisplay-Biopanning-Technologie in Kombination mit Hochdurchsatz-Sequenzierung kann ein wirksames Hilfsmittel für die Ermittlung von Tumorantikörper-Therapeutika und möglicherweise für die Identifizierung neuartiger Tumor-Antigene darstellen.

Item Type: Ph.D. Thesis
Erschienen: 2020
Creators: Sapir, Ashi
Title: Evaluation of Yeast Display Fab Libraries Derived from Tumor Infiltrating B Cells
Language: English
Abstract:

Seit ihrer erstmaligen klinischen Zulassung für die Krebsbehandlung Ende der 1990er gelten monoklonale Antikörper (mAbs) als einer der erfolgreichsten und vielversprechendsten Behandlungsansätze in der Onkologie. mAbs, die gezielt auf tumorassoziierte Antigene (TAA) einwirken, und seit neuerem mAbs, welche die durch Checkpoints vermittelte Hemmung der T-Zell-Tumorantwort verhindern, haben sich als hinsichtlich der Tumorremission bei Krebspatienten wirksam erwiesen (Carter and Lazar, 2018). Dennoch gibt es auch in der Entwicklung von mAbs für die Krebsbehandlung Grenzen und viele mAbs kommen aufgrund der niedrigen Zulassungsrate nicht in der klinischen Praxis zur Anwendung (Nelson and Reichert, 2009; Workman et al., 2017). Nach mehr als 20 Jahren der Entwicklung gibt es noch immer relativ wenige tumorassoziierte Antigene (TAA) als Targets für die mAbs-Therapie, die für die klinische Therapie zugelassen sind. Daher müssen neue Ansätze und Strategien im Prozess der Selektion von mAbs gefunden werden, die zur Ermittlung neuer TAA bzw. besserer, neuartiger mAbs für die Krebstherapie führen können (Sánchez-Martín et al., 2015). Zahlreiche Publikationen haben in den letzten Jahren gezeigt, dass das Vorliegen von tumorinfiltrierenden B-Zellen (TIL-B) in den Tumoren eines Patienten mit einem positiven Prognoseeffekt verbunden ist (Wouters and Nelson, 2018). Mehrere Veröffentlichungen deuten zudem darauf hin, dass TIL-B aus Patientengewebe eine reichhaltige Quelle für tumorbindende Antikörper sein können (Pavoni et al., 2007; Novinger, Ashikaga and Krag, 2015). In der hier vorgestellten Studie wurden – soweit uns bekannt erstmalig – TIL-B-Antikörper-Repertoires von 8 Patienten mit kolorektalem Karzinom genutzt, um 2 Hefe-Fab-Oberflächendisplay-Bibliotheken (κ und λ) zu erstellen. Die Evaluierung der Bibliotheken anhand von Durchflusszytometrie-Screening im Hinblick auf eine Vielzahl von TAA- und Immun-Checkpoint-Molekülen führte zur Ermittlung mehrerer potenzieller Bindungspartner für diese Screeningtargets. Danach erfolgte anhand von Durchflusszytometrie eine Sortierung im Hinblick auf 4 Targets: CEACAM5, LRP6, LAG3 und OX40L. Dies erlaubte die Selektion spezifischer, aber niedrig-affiner humaner Antikörper für diese Targets. Die weitere Evaluierung der Bibliotheken umfasste einen neuartigen Ansatz: Dabei erfolgte ein phänotypisches Screening mithilfe einer Hefedisplay-Biopanning-Plattform gegen entsprechende aus kolorektalen Karzinomen abgeleitete Zelllinien (HCT 116, HT-29 und SW620). Eine hohe Anreicherung der Hefe-Fab-Oberflächendisplay-Bindungspartner an den aus kolorektalen Karzinomen abgeleiteten Zellen ließ sich innerhalb von nur 3 Runden Biopanning beobachten. Mithilfe des Biopanning-Verfahrens isolierte Antikörper (HCT 116, HT-29) zeigten eine selektive Bindung an ähnlichen Epitopen wie sie auf der Zelloberfläche von HCT116- und HT-29-Zellen vorhanden sind, da diese Antikörper dieselbe schwere Kette aufwiesen, obwohl sie aus zwei unterschiedlichen Zelllinien selektiert wurden. Die unterschiedlichen leichten Ketten der isolierten Antikörper hatten nachweislich Einfluss auf ihre Affinität. Die weitere Charakterisierung eines der isolierten Antikörper (TILB-HCT116-B24) ergab einen EC50-Wert von 569 nM bei Bindung an HCT116. Ein Zellbindungsassay anhand von Fluoreszenzmikroskopie mit diesem Antikörper an HCT 116-Zellen und normalen Fibroblastenzellen aus dem Colon (CCD-18Co) belegte die spezifische Bindung an HCT 116-Zellen. Soweit uns bekannt ist, ist dies die erste Studie, in der Next-Generation Sequencing (NGS) als Hochdurchsatz-Sequenzierung für die aus den TIL-B-Zellen der einzelnen Patienten abgeleiteten Klone im Hinblick auf die Fab-Hefeoberflächendisplay-Bibliotheken und die Klone aus der Biopanning-Anreicherung eingesetzt wurde. Diese NGS-Daten, die auf der klonalen Frequenzanalyse der schweren und leichten Kettensequenzen jedes Patienten basieren, können einen Hinweis auf die klonale Expansion von TIL-B geben, die im Tumor der Patienten auftritt. Zudem führte die Kombination von Hochdurchsatz-Sequenzierung und Hefe-Display-Biopanning-Screening zu einer ähnlich selektiven Anreicherung, wie wenn Biopanning der Hefe-Bibliothek gegen die aus kolorektalen Karzinomen abgeleiteten Zelllinien HCT 116 und HT-29 erfolgte. Hierbei fiel das Biopanning-Ergebnis gegen die aus kolorektalen Karzinomen abgeleitete SW620-Zelllinie anders aus: Es ergab andere Klone, was auf eine hochspezifische Selektion mithilfe des Biopanning-Prozesses schließen lässt. So unterstützt die vorgestellte Studie die Hypothese, dass aus TIL-B abgeleitete Bibliotheken ein Antikörper-Repertoire enthalten, das vorzugsweise an Krebszellen bindet. Die Hefeoberflächendisplay-Biopanning-Technologie in Kombination mit Hochdurchsatz-Sequenzierung kann ein wirksames Hilfsmittel für die Ermittlung von Tumorantikörper-Therapeutika und möglicherweise für die Identifizierung neuartiger Tumor-Antigene darstellen.

Place of Publication: Darmstadt
Divisions: 07 Department of Chemistry
07 Department of Chemistry > Fachgebiet Biochemie
07 Department of Chemistry > Fachgebiet Biochemie > Biologische Chemie
Date Deposited: 02 Feb 2020 20:55
DOI: 10.25534/tuprints-00011371
Official URL: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/11371
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-113714
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald and Hausch, Prof. Dr. Felix
Refereed / Verteidigung / mdl. Prüfung: 27 May 2019
Alternative Abstract:
Alternative abstract Language
Since their first clinical approval for cancer therapy in the late 1990s, monoclonal antibodies (mAbs) are considered as one of the most successful and promising therapeutic approaches in oncology. mAbs, which target tumor-associated antigens (TAA) and more recently mAbs which prevent checkpoint-mediated inhibition of T cell responses against the tumor, proved to be affective for tumor remission in cancer patients (Carter & Lazar, 2018). However, the development of mAbs for cancer therapy still has it’s limitations and many mAbs do not arrive to the clinic due to low approval rate (A. L. Nelson & Reichert, 2009; Workman, Draetta, Schellens, & Bernards, 2017). Over 20 years of development there are still relatively few tumor-associated antigens (TAA) for mAbs targeting in oncology that are approved for clinical therapy. This raises the need for the development of new approaches and strategies in the mAbs selection process that may result in finding new TAA and/or better novel mAbs for cancer therapy (Sánchez-Martín et al., 2015). In recent years, it was shown in many reports that the presence of infiltrating B cells (TIL-B) in patient’s tumors is associated with positive prognostic effect (Wouters & Nelson, 2018). Moreover, several reports indicate that TIL-B from patient’s tissue can be a rich source of tumor-binding antibodies (Novinger, Ashikaga, & Krag, 2015; Pavoni et al., 2007) In the presented study, to our knowledge for the first time, TIL-B antibody repertoires from 8 colon cancer patients were utilized to construct 2 yeast Fab surface display libraries (κ and λ). Evaluation of the libraries by flow cytometry screening to a variety of TAA and immune checkpoint molecules, revealed potential binders to these screened targets. Subsequent flow cytometry sorting to 4 targets: CEACAM5, LRP6, LAG3 and OX40L resulted in the selection of specific but low-affinity human antibodies to the targets. Further evaluation of the libraries involved a novel approach using phenotypic screening by a yeast display biopanning platform against corresponded colon cancer derived cell lines (HCT 116, HT-29 and SW620). High enrichment of yeast Fab surface display binders to the colon cancer derived cells was observed within only 3 rounds of biopanning. Isolated antibodies from the biopanning approach (HCT 116, HT-29) demonstrated a selective binding to similar epitopes present on the cell surface of HCT116 and HT-29 cells, as these antibodies were found to have the same heavy chain though they were selected on two different cell lines. The different light chains in the isolated antibodies were found to influence the antibodies affinity. Further characterization of one of the isolated antibodies (TILB-HCT116-B24) indicated an EC50 value of 569nM binding to HCT116. A cellular binding assay using fluorescence microscopy with this antibody to HCT 116 cells and normal colon fibroblast cells (CCD-18Co) showed specific binding to HCT 116 cells. To our knowledge, this is the first study to use next-generation sequencing (NGS) to provide a high-throughput sequencing for the clones derived from each patients’ TIL-B cells, for the Fab yeast surface display libraries and for the biopanning enrichment clones. This NGS data, based on clonal frequency analysis of each patient’s heavy and light chain sequences, may indicate the clonal expansion of the TIL-B that occurs in the patients’ tumor. Moreover, combining high-throughput sequencing and yeast display biopanning screening, demonstrated similar selective enrichment occurred when biopanning the yeast library against colorectal derived cell lines HCT116 and HT-29. This was different from the biopanning against the metastatic colorectal derived SW620 cell line, which gave different clones, indicating high specific selection through the biopanning process. Hence, the presented study supports the hypothesis that TIL-B derived libraries contain a repertoire of antibodies that can bind preferentially to cancer cells. The yeast surface display biopanning technology combined with high-throughput sequencing, could be effective tools for the discovery of antitumor antibody therapeutics and possibly for identifying novel tumor antigens.English
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