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Einflüsse verschiedener Membranen auf die viralen Kaliumkanäle KcvNTS, KcvS und Kmpv12T

Winterstein, Laura-Marie (2019):
Einflüsse verschiedener Membranen auf die viralen Kaliumkanäle KcvNTS, KcvS und Kmpv12T.
Darmstadt, Technische Universität, [Online-Edition: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/8806],
[Ph.D. Thesis]

Abstract

Es ist seit langem bekannt, dass die Funktion von Membranproteinen nicht nur auf ihre eigene Struktur zurückzuführen ist, sondern auch durch die chemisch - physikalischen Eigenschaften der Membran moduliert wird. Am besten kann man solche Interaktionen an Ionenkanälen untersuchen, da sich Funktionsänderungen sogar an einzelnen Proteinen durch Änderung des elektrischen Stromes sehr einfach quantifizieren lassen. Es gibt Ionenkanäle wie Kir - Kanäle, die für ihre Funktion auf spezielle Membranlipide angewiesen sind und wiederum andere, dessen Funktion durch die Membran lediglich beeinflusst werden. Dabei spielen chemisch - physikalische Eigenschaften wie Membrandicke, lateraler Druck, Fluidität und die Eigenschaften der Lipidkopfgruppen eine große Rolle. Um die Auswirkungen von Membranen auf die Funktion von Ionenkanälen zu untersuchen wurden in dieser Arbeit virale Kaliumkanäle verwendet, die aufgrund ihrer minimalistischen Struktur gänzlich in eine Doppellipidmembran eingebettet sind und somit deren Eigenschaften komplett ausgesetzt sind. Bei den untersuchten Kaliumkanälen handelt es sich um zwei Kcv - Kanäle, KcvNTS und KcvS mit jeweils 82 AS pro Monomer und um Kmpv12T, dem bisher kleinsten bekannten Kaliumkanal mit nur 78 AS pro Monomer. Um die Funktion der drei Kanäle in verschiedenen artifiziellen Membranen zu untersuchen wurden die Planare Lipid Bilayer Methode, sowie die Contact Bubble Bilayer Methode verwendet. Um die korrekte Faltung der Kanalproteine zu gewährleisten wurden sie in Anwesenheit sogenannter Nanodisks exprimiert; kleinen Membranen, die von einem Gerüstprotein umschlossen sind. Diese Expressionsmethode wurde in der vorliegenden Arbeit auf die Anwendbarkeit in verschiedenen Messsystemen, auf verschiedene Ionenkanäle sowie auf die Eignung für anschließende Protein-Lipid-Interaktionsuntersuchungen getestet. Des Weiteren konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Offenwahrscheinlichkeit von KcvS durch monovalent anionische Lipide von 35% auf 90% erhöht wird. Durch nähere Analysen wurde festgestellt, dass dies durch eine Konformationsänderung des Proteins zustande kommt, die der einer Mutation an Position 77 (S77G) sehr ähnlich ist und die Funktion des inneren Gates beeinflusst. Dies lässt den Schluss zu, dass die Auswirkungen von Punktmutationen durch eine bestimmte Membranzusammensetzung aufgehoben werden können. In Zusammenarbeit mit der Universität Mailand wurde zudem festgestellt, dass KcvNTS in cholesterolhaltigen Membranen in der Lage ist sich seine Membranumgebung selbst zu schaffen, also die Bildung von Micro - Domänen wie Lipid - Rafts zu induzieren, indem er eine Cholesterolkonzentration von ungefähr 20 mol% um sich rekrutiert.

Item Type: Ph.D. Thesis
Erschienen: 2019
Creators: Winterstein, Laura-Marie
Title: Einflüsse verschiedener Membranen auf die viralen Kaliumkanäle KcvNTS, KcvS und Kmpv12T
Language: German
Abstract:

Es ist seit langem bekannt, dass die Funktion von Membranproteinen nicht nur auf ihre eigene Struktur zurückzuführen ist, sondern auch durch die chemisch - physikalischen Eigenschaften der Membran moduliert wird. Am besten kann man solche Interaktionen an Ionenkanälen untersuchen, da sich Funktionsänderungen sogar an einzelnen Proteinen durch Änderung des elektrischen Stromes sehr einfach quantifizieren lassen. Es gibt Ionenkanäle wie Kir - Kanäle, die für ihre Funktion auf spezielle Membranlipide angewiesen sind und wiederum andere, dessen Funktion durch die Membran lediglich beeinflusst werden. Dabei spielen chemisch - physikalische Eigenschaften wie Membrandicke, lateraler Druck, Fluidität und die Eigenschaften der Lipidkopfgruppen eine große Rolle. Um die Auswirkungen von Membranen auf die Funktion von Ionenkanälen zu untersuchen wurden in dieser Arbeit virale Kaliumkanäle verwendet, die aufgrund ihrer minimalistischen Struktur gänzlich in eine Doppellipidmembran eingebettet sind und somit deren Eigenschaften komplett ausgesetzt sind. Bei den untersuchten Kaliumkanälen handelt es sich um zwei Kcv - Kanäle, KcvNTS und KcvS mit jeweils 82 AS pro Monomer und um Kmpv12T, dem bisher kleinsten bekannten Kaliumkanal mit nur 78 AS pro Monomer. Um die Funktion der drei Kanäle in verschiedenen artifiziellen Membranen zu untersuchen wurden die Planare Lipid Bilayer Methode, sowie die Contact Bubble Bilayer Methode verwendet. Um die korrekte Faltung der Kanalproteine zu gewährleisten wurden sie in Anwesenheit sogenannter Nanodisks exprimiert; kleinen Membranen, die von einem Gerüstprotein umschlossen sind. Diese Expressionsmethode wurde in der vorliegenden Arbeit auf die Anwendbarkeit in verschiedenen Messsystemen, auf verschiedene Ionenkanäle sowie auf die Eignung für anschließende Protein-Lipid-Interaktionsuntersuchungen getestet. Des Weiteren konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Offenwahrscheinlichkeit von KcvS durch monovalent anionische Lipide von 35% auf 90% erhöht wird. Durch nähere Analysen wurde festgestellt, dass dies durch eine Konformationsänderung des Proteins zustande kommt, die der einer Mutation an Position 77 (S77G) sehr ähnlich ist und die Funktion des inneren Gates beeinflusst. Dies lässt den Schluss zu, dass die Auswirkungen von Punktmutationen durch eine bestimmte Membranzusammensetzung aufgehoben werden können. In Zusammenarbeit mit der Universität Mailand wurde zudem festgestellt, dass KcvNTS in cholesterolhaltigen Membranen in der Lage ist sich seine Membranumgebung selbst zu schaffen, also die Bildung von Micro - Domänen wie Lipid - Rafts zu induzieren, indem er eine Cholesterolkonzentration von ungefähr 20 mol% um sich rekrutiert.

Place of Publication: Darmstadt
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Plant Membrane Biophysics
Date Deposited: 14 Jul 2019 19:55
Official URL: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/8806
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-88066
Referees: Schroeder, Dr. Indra and Bertl, Prof. Dr. Adam
Refereed / Verteidigung / mdl. Prüfung: 13 June 2019
Alternative Abstract:
Alternative abstract Language
It has been known for decades that the function of membrane proteins is not only due to their own structure but is also modulated by the chemical and physical properties of the membrane. These interactions can easily be investigated with ion channels, since functional changes can be quantified by changes in the electrical current, even on single protein level. There are ion channels such as Kir channels, which need special membrane lipids for proper function and others, whose function are merely influenced by the membrane. Therefore, chemical and physical properties, such as membrane thickness, lateral pressure, fluidity and the properties of the lipid head groups play an important role. In order to investigate the effects of membranes on the function of ion channels, viral potassium channels were used in this work. Due to their minimalistic structure, they are completely embedded in a lipid bilayer and are therefore completely exposed to its properties. The investigated potassium channels are two Kcv channels, KcvNTS and KcvS with 82 AS per monomer and Kmpv12T, the so far smallest known potassium channel with only 78 AS per monomer. The Planar Lipid Bilayer and the Contact Bubble Bilayer method were used to investigate the function of these three channels in different artificial membranes. To ensure the correct folding of the channel proteins, they were expressed in the presence of so-called nanodiscs; small membranes enclosed by a scaffold protein. In the present work, the applicability of this expression method was tested in different measurement systems, with different ion channels and for its suitability for subsequent investigation of protein-lipid interactions. Furthermore, it was shown that the open probability of KcvS is increased from 35% to 90% using monovalent anionic lipids. Further analysis has shown that this is due to a conformational change of the protein that is very similar to a mutation at position 77 (S77G) and affects the function of the inner gate. This leads to the conclusion that the effects of point mutations can be neutralized by a specific membrane composition. In cooperation with the University of Milan, it was also found that KcvNTS can create its own membrane environment in cholesterol-containing membranes, i.e. to induce the formation of micro-domains such as lipid rafts, by recruiting a cholesterol concentration of approximately 20 mol% around itself.English
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